La microscopía óptica es el método más antiguo y al mismo tiempo uno de los más comunes de investigación y estudio de células vegetales y animales. Se supone que el inicio del estudio de la célula fue precisamente con la invención del microscopio óptico de luz. La característica principal de un microscopio óptico es la resolución de un microscopio óptico, que está determinada por la longitud de onda de la luz. El límite de resolución de un microscopio óptico está determinado por la longitud de onda de la luz, un microscopio óptico se utiliza para estudiar estructuras que tienen un tamaño mínimo igual a la longitud de onda de la radiación de luz. Muchas células constituyentes tienen una densidad óptica similar y requieren un tratamiento previo antes de la microcopia; de lo contrario, son prácticamente invisibles en un microscopio óptico convencional. Para hacerlos visibles se utilizan diversos colorantes con cierta selectividad. Usando tintes selectivos, es posible estudiar la estructura interna de la célula con más detalle.
Por ejemplo:
el tinte de hematoxilina tiñe algunos componentes del núcleo en azul o púrpura;
después del tratamiento sucesivo con floroglucinol y luego con ácido clorhídrico, las membranas celulares lignificadas se vuelven de color rojo cereza;
el colorante Sudán III tiñe de rosa las membranas celulares corchosas;
una solución débil de yodo en yoduro de potasio vuelve azules los granos de almidón.
Al realizar exámenes microscópicos, la mayoría de los tejidos se fijan antes de la tinción.
Después de la fijación, las células se vuelven permeables a los colorantes y la estructura celular se estabiliza. Uno de los fijadores más comunes en botánica es el alcohol etílico.
Durante la preparación de la preparación para microcopia, se realizan secciones delgadas en un micrótomo (Apéndice 1, Fig. 1). Este aparato utiliza el principio de una rebanadora de pan. Se hacen secciones ligeramente más gruesas para los tejidos vegetales que para los animales, ya que las células vegetales son relativamente más grandes. El grosor de las secciones de tejidos vegetales para - 10 micras - 20 micras. Algunas telas son demasiado suaves para cortarlas de inmediato. Por ello, tras su fijación, se vierten en parafina fundida o una resina especial, que impregnan todo el tejido. Después del enfriamiento, se forma un bloque sólido, que luego se corta en un micrótomo. Esto se debe al hecho de que las células vegetales tienen paredes celulares fuertes que forman el marco del tejido. Las conchas lignificadas son especialmente duraderas.
Usando el relleno durante la cocción, el corte plantea el peligro de violar la estructura de la celda, para evitar esto, se utiliza el método de congelación rápida. Al usar este método, se prescinde de la fijación y el vertido. El tejido congelado se corta en un micrótomo especial, un criotomo (Apéndice 1, Fig. 2).
Las secciones congeladas conservan mejor las características de la estructura natural. Sin embargo, son más difíciles de cocinar y la presencia de cristales de hielo rompe algunos detalles.
Los microscopios de contraste de fase (ap. 1, fig. 3) y de interferencia (ap. 1, fig. 4) le permiten examinar células vivas bajo un microscopio con una clara manifestación de los detalles de su estructura. Estos microscopios utilizan 2 haces de ondas de luz que interactúan (se superponen) entre sí, aumentando o disminuyendo la amplitud de las ondas que ingresan al ojo desde diferentes componentes de la célula.
La microscopía de luz tiene varias variedades.
Ejercicio 1.
Considere el esquema propuesto de direcciones de evolución. Escribe en la respuesta el término que falta, indicado por un signo de interrogación en el diagrama.
Explicación: una línea pasada por alto del progreso biológico es la idioadaptación. idioadaptación- un cambio particular en el organismo que no conduce a un aumento en el nivel de organización (pubescencia de las hojas, decoloración, etc.).
La respuesta correcta es idioadaptación.
Tarea 2.
Elija dos respuestas correctas de cinco y escriba los números debajo de los cuales se indican.
Con la ayuda de microscopía de luz en una célula vegetal se puede distinguir.
1. Retículo endoplásmico
2. Microtúbulos
3. Vacuola
4. Pared celular
5. Ribosomas
Explicación: usando microscopía óptica, solo se pueden distinguir grandes partes de la célula, como la pared celular y la vacuola (en células viejas, la vacuola ocupa casi todo el espacio intracelular). Los orgánulos más pequeños (microtúbulos, retículo endoplásmico y ribosomas) solo se pueden ver con un microscopio electrónico.
La respuesta correcta es 34.
Tarea 3.
¿Cuántas moléculas de ADN están contenidas en el núcleo de la célula después de la replicación si el conjunto diploide contiene 46 moléculas de ADN? Escriba sólo el número apropiado en su respuesta.
Explicación: replicación - duplicación de moléculas de ADN, lo que significa que 46 moléculas después de duplicarse se convierten en 92 moléculas.
La respuesta correcta es 92.
Tarea 4.
Todos los signos enumerados a continuación, excepto dos, se utilizan para describir la estructura y las funciones del retículo endoplásmico. Identifique dos características que "se caen" de la lista general.
1. Desglose de proteínas
2. Transporte de sustancias
3. Fosforilación oxidativa
4. Síntesis de proteínas en ribosomas.
5. Separación del citoplasma en compartimentos
Explicación: el retículo endoplásmico rodea el núcleo, dividiendo así el citoplasma en compartimentos y realizando el transporte intracelular de sustancias. EPS es suave y áspero. Rough ER lleva a cabo la síntesis de proteínas con la ayuda de los ribosomas que se encuentran en las membranas de la red.
La respuesta correcta es 13.
Tarea 5.
Establecer una correspondencia entre los procesos y fases de la mitosis.
Procesos
A. Se forma una membrana nuclear.
B. Los cromosomas hermanos divergen
B. El huso de la división finalmente desaparece
D. Los cromosomas se desspiralizan
D. Los centrómeros de los cromosomas se separan
Fases de la mitosis
1. Anafase
2. Telofase
Explicación: la anafase es la fase de división más rápida, ya que los cromosomas se separan en los polos de la célula (y los centrómeros de los cromosomas se separan). Todos los demás procesos ocurren después de la divergencia de los cromosomas, en la telofase.
La respuesta correcta es 21221.
Tarea 6.
¿Cuántos fenotipos diferentes se producen al cruzar dos plantas de guisantes de olor heterocigotas con flores rosadas (el rojo es incompletamente dominante sobre el blanco)? En su respuesta, anote solo el número de fenotipos.
Explicación: con dominancia incompleta, la combinación de genes para los colores rojo (A) y blanco (a) da rosa (A). Cruzamos dos plantas de ceta rosa:
R: Aa x Aa
G: A, a x A, a
F1: obtenemos división por genotipo - 1AA:2Aa:1aa
División por fenotipo: 1: 2: 1 (25% - rojo, 50% - rosa, 25% - flores blancas).
La respuesta correcta es 3.
Tarea 7.
Todos los signos siguientes, excepto dos, caracterizan la variabilidad de la modificación. Identifique dos signos que "se caen" de la lista general y anote los números bajo los cuales se indican.
1. Diferentes formas de hojas de punta de flecha bajo el agua y sumergidas
2. Ojos marrones y azules en miembros de una misma familia
3. Variación en el tamaño de los tubérculos de una planta de papa
4. La diferencia en la longitud de las hojas de un abedul desde los lados norte y sur.
5. Tener hijos con síndrome de Down
Explicación: Variabilidad de modificación- variabilidad de un organismo particular (o grupo de organismos) dependiendo de las condiciones ambientales dentro de los límites de la norma de reacción. Tal variabilidad afecta el fenotipo del organismo, pero no afecta el genotipo, por lo que tales modificaciones no se heredan. Por lo tanto, los ejemplos de este tipo de variabilidad no pueden ser rasgos genéticos: diferente color de ojos y síndrome de Down.
La respuesta correcta es 25.
Tarea 8.
Establecer una correspondencia entre procesos y departamentos de planta.
Procesos
A. Formación de endospermo
B. Formación de un crecimiento verde
B. Fusión de gametos inmóviles
D. Desarrollo del tubo polínico
D. Reproducción y dispersión por esporas
Departamentos de planta
2. helechos
Explicación: Los helechos forman un crecimiento verde (a partir de esporas), y también se reproducen y se asientan por esporas. Sus células reproductivas masculinas son móviles y la fertilización ocurre solo en el agua.
La respuesta correcta es 12112.
Tarea 9.
¿Cuáles son las características del organismo que se muestra en la figura?
1. Sistema circulatorio cerrado
2. División del cuerpo en cabeza, tórax y abdomen
3. Cordón nervioso abdominal
4. Cuatro pares de patas
5. Un par de antenas
6. Respiración con sacos pulmonares y tráquea
Explicación: los arácnidos tienen cuatro pares de patas, un sistema circulatorio abierto, secciones del cuerpo: el cefalotórax y el abdomen, hay una cadena nerviosa abdominal, respiran con la ayuda de los sacos pulmonares y la tráquea. No hay bigotes.
La respuesta correcta es 346.
Tarea 10.
Establecer una correspondencia entre las características de los organismos y los reinos para los que son característicos.
Signos de organismos
A. Tipo de nutrición heterótrofa
B. La presencia de quitina en el esqueleto externo.
B. Presencia de tejido educativo
D. Regulación de la actividad vital solo con la ayuda de productos químicos.
D. La formación de urea en el proceso de metabolismo.
E. Presencia de una pared celular rígida hecha de polisacáridos
reinos
1. Plantas
2. Animales
Explicación: los signos de los animales incluyen un tipo de nutrición heterotrófica, la presencia de quitina en el esqueleto externo y la formación de urea en el proceso del metabolismo de las proteínas.
La presencia de tejido educativo, la regulación de la actividad vital con la ayuda de productos químicos y la presencia de una pared celular se pueden atribuir a los signos de las plantas.
Las plantas son autótrofas, ya que consumen sustancias inorgánicas y las transforman en sustancias orgánicas. El esqueleto externo está disponible solo en animales (artrópodos), los animales solo tienen tejido nervioso, epitelial, muscular y conectivo, y las plantas tienen tejido educativo, mecánico, tegumentario, básico y conductivo. Los animales regulan los procesos internos con la ayuda de la regulación nerviosa y humoral, y las plantas solo con la ayuda de productos químicos. La urea se forma en los animales. La pared celular (hecha de celulosa) está presente en las plantas y ausente en los animales.
La respuesta correcta es 221121.
Tarea 11.
Establecer la secuencia de arreglo de los taxones sistemáticos, comenzando por el más grande.
1. Plantas
2. Arbusto de cereza
3. Rosáceas
4. Dicotiledóneas
5. Angiospermas
6. cereza
Explicación: ordenar los taxones, empezando por el más grande.
Reino - Plantas
Departamento - Angiospermas
Clase - Dicotiledóneas
Familia - Rosáceas
Varilla - Cereza
Vista - Arbusto de cerezo
La respuesta correcta es 154362.
Tarea 12.
Elija tres respuestas correctas de seis y escriba los números debajo de los cuales se indican.
1. Estrechamiento de las arterias pulmonares
2. Aumento de la respiración
3. Evaporación de agua a través de las glándulas sudoríparas
4. Cambio en la tasa de coagulación de la sangre
5. Expansión de los capilares de la piel
6. Presión arterial más baja
Explicación: durante la transferencia de calor, las arterias pulmonares se estrechan (debido al aumento de la presión), la evaporación del agua a través de las glándulas sudoríparas y la expansión de los capilares de la piel (la piel se vuelve roja).
La respuesta correcta es 135.
Tarea 13.
Establecer una correspondencia entre las estructuras del oído y los departamentos en los que se encuentran.
Estructura
A. Pabellón
B. Ventana ovalada
V. caracol
G. Stremechko
D. trompa de Eustaquio
E martillo
Departamentos
1. oído externo
2. oído medio
3. oído interno
Explicación: miremos la imagen
Referimos el pabellón auricular al oído interno, los huesecillos del oído (estribo de martillo) al oído medio, la ventana oval, la cóclea y la trompa de Eustaquio al oído interno.
La respuesta correcta es 133232.
Tarea 14.
Organice en el orden correcto la subordinación de sistemas de diferentes niveles, comenzando con el más grande.
1. Elementos en forma
2. Eritrocitos
3. Hemoglobina
4. iones de hierro
5. Tejido conectivo
6. Sangre
Explicación: organizamos las estructuras, comenzando con la más grande: tejido conectivo - sangre - elementos formados - eritrocitos - hemoglobina - ion de hierro. El hierro es parte de la proteína hemoglobina, que transporta oxígeno y se encuentra en el eritrocito, una célula sanguínea. La sangre es uno de los tipos de tejido conectivo.
La respuesta correcta es 561234.
Tarea 15.
Lee el texto. Elige tres frases que describan el criterio ecológico de la especie vegetal Pemphigus vulgaris. Anote los números bajo los cuales se indican.
1. El pénfigo vulgar se encuentra principalmente en la región mediterránea de Europa y África. 2. El pénfigo vulgar crece en zanjas, estanques, embalses estancados y de flujo lento, pantanos. 3. Las hojas de las plantas se diseccionan en numerosos lóbulos filiformes, las hojas y los tallos están provistos de vesículas. 4. El pénfigo florece de junio a septiembre. 5. Las flores están pintadas de amarillo, sientan 5-10 por pedúnculo. 6. El pénfigo vulgar es una planta insectívora.
Explicación: Un criterio ecológico describe el modo de vida de una especie por su relación con otros organismos. Oración 2: describe las características del hábitat (no lugares específicos, sino en general).
Propuesta 4 - tiempo de floración (y por lo tanto polinización).
Propuesta 6 - Características nutricionales.
La respuesta correcta es 246.
Tarea 16.
Empareja ejemplos y evidencias de la evolución.
Ejemplos
A. Formas de transición fósiles
B. Órganos homólogos
B. Rudimentos
D. Fósiles
D. Atavismos
E. Plan de cuerpo único
Evidencia de la evolución
1. Paleontológico
2. Comparación anatómica
Explicación: a la evidencia paleontológica nos referimos a lo que los científicos encuentran: formas de transición fósiles, fósiles. Todo lo demás es evidencia anatómica comparativa: órganos homólogos, rudimentos, atavismos, un solo plan estructural.
Atavismo- la aparición de signos en el cuerpo característicos de los antepasados lejanos (línea capilar, multimamaria, etc.).
Rudimentos- órganos que han perdido su función (muelas del juicio, apéndice, cóccix, tercer párpado, etc.).
La respuesta correcta es 122122.
Tarea 17.
Elija tres respuestas correctas de seis y escriba los números debajo de los cuales se indican.
Los consumidores en un ecosistema son
2. Bacterias de la podredumbre
3. Plantas verdes
4. Artiodáctilos
5. Depredadores
6. Cianobacterias
La respuesta correcta es 145.
Tarea 18.
Establecer una correspondencia entre rasgos y ecosistemas.
señales
A. Redes eléctricas ramificadas
B. Cadenas alimentarias cortas
B. Baja autorregulación
D. Variedad de productores
D. Diversidad de especies de animales
E. Dominio de los monocultivos
ecosistemas
1. Estepa de hierba pluma
2. Campo de trigo
Explicación: de hecho, en la tarea es necesario distinguir el ecosistema natural (estepa de pasto pluma) del agroecosistema (campo de trigo).
El agroecosistema se caracteriza por cadenas alimentarias cortas, baja autorregulación y predominio de monocultivos. Todo lo demás es señal de un ecosistema natural sostenible.
La respuesta correcta es 122112.
Tarea 19.
Establecer la secuencia de aparición y desarrollo de los ecosistemas sobre rocas desnudas.
1. Escalar líquenes y bacterias.
2. Comunidad herbácea-arbustiva
3. Comunidad forestal
4. Plantas herbáceas con flores.
5. Musgos y líquenes fruticosos
Explicación: sobre rocas desnudas se forma una comunidad vegetal de la misma manera que se desarrolla la vida vegetal en la Tierra. Es decir, escamas líquenes y bacterias, luego musgos y líquenes fruticosos, luego plantas herbáceas con flores, comunidad herbáceo-arbustiva y, finalmente, comunidad forestal.
La respuesta correcta es 15423.
Tarea 20.
Considere el dibujo que representa la fase del ciclo cardíaco. Determine el nombre de esta fase, su duración y la dirección del flujo sanguíneo. Complete las celdas en blanco de la tabla usando los términos de proceso de la lista.
Lista de términos y procesos:
1. Sístole ventricular
2. Sístole auricular
3. El flujo de sangre de los ventrículos a las arterias
4. 0,1 s
5.0.8s
6. El flujo de sangre de la aurícula al ventrículo
7. El flujo de sangre de las venas a la aurícula
8.0.3 s
Explicación: la figura muestra la fase de contracción auricular (sístole auricular). En este caso, la sangre de la aurícula ingresa al ventrículo. El proceso es muy rápido y tarda 0,1 s.
La respuesta correcta es 246.
Tarea 21.
Analice la tabla "Tiempo necesario para reconocer la imagen de prueba". A los sujetos se les mostró números de diferentes colores e imágenes en blanco y negro de diversa complejidad. Se registró el tiempo necesario para que el sujeto reconociera y nombrara el objeto.
|
Imágenes |
Tiempo medio de reconocimiento (ms) |
|
Simple |
25,0 |
|
Dificultad media |
37,5 |
|
Complejo |
70,0 |
|
números negros |
27,5 |
|
numeros rojos |
37,5 |
|
números azules |
62,5 |
|
numeros verdes |
45,0 |
|
numeros amarillos |
67,5 |
Seleccione afirmaciones que puedan formularse con base en el análisis de los datos presentados.
1. El tiempo de reconocimiento de números no depende de su color.
2. Los objetos negros se reconocen más rápido que los de color
3. Cuanto más simple es el objeto, menos luz se necesita para reconocerlo.
4. Los números de colores se reconocen más rápido que las imágenes complejas
5. Al anochecer, el reconocimiento de un objeto de color se debilita
Explicación: Según los datos proporcionados en la tabla, los objetos negros se reconocen más rápido que los objetos de color (27,5 ms y 37,5 - 67,5 ms). Y los números de colores (máx. - 67,5 ms se reconocen más rápido que una imagen compleja (70,0 ms). El resto de las afirmaciones no son ciertas o contienen datos que no están en la tabla.
La respuesta correcta es 24.
Tarea 22.
Es bien sabido que la sangre humana contiene proteínas y glucosa. ¿Por qué una sola inyección de glucosa en la sangre no es peligrosa para el cuerpo, pero la introducción de la mayoría de las proteínas es peligrosa?
Explicación: con una sola introducción de glucosa en la sangre, las hormonas del metabolismo de los carbohidratos la descomponen. La glucosa es una molécula familiar para la sangre humana (y la principal molécula de energía), y las proteínas (no reguladoras) no deben estar en la sangre en el estado normal (ya que son polímeros), los monómeros de proteínas (aminoácidos) ingresan a la sangre desde el tracto gastrointestinal. Las proteínas son de naturaleza antigénica y el cuerpo humano las percibirá como una molécula extraña.
Tarea 23.
Nombra el objeto que se muestra en la imagen. Indique el nombre y las funciones de las estructuras presentes en la imagen.
Explicación: La figura muestra un bacteriófago (virus bacteriano). Podemos distinguir la cabeza (cápside de proteína: realiza una función protectora, ya que contiene un ácido nucleico: ADN o ARN); proceso de cola con una placa basal: a través del proceso, el virus inyecta ácido nucleico en la célula afectada; fibrillas: con la ayuda de ellas, el virus se arraiga en la pared celular.
Tarea 24.
Encuentra tres errores en el texto dado. Indique el número de oraciones en las que se cometieron errores, corríjalos.
(1) Los peces son habitantes del medio ambiente acuático. (2) Según el origen y las características estructurales de los peces, se dividen en 2 clases: peces cartilaginosos y peces óseos. (3) La cabeza, apuntando al frente, se fusiona con el cuerpo, que comienza en el borde libre de las branquias y termina en la región caudal. (4) En todos los peces, las branquias se abren en el exterior del cuerpo con hendiduras branquiales. (5) Todos los peces tienen vejiga natatoria. (b) Los peces óseos más antiguos son los de aletas lobuladas. (7) Se caracterizan por aletas carnosas y escamosas, una notocorda desarrollada en peces adultos, una vejiga natatoria poco desarrollada y otras características.
Explicación: oración 3 - el cuerpo no termina con la cola, sino con el ano.
Proposición 4: no todas las branquias de los peces se abren fuera del cuerpo con hendiduras branquiales. En muchos peces, las branquias están cubiertas con cubiertas branquiales (peces óseos).
Sugerencia 5: vejigas natatorias: un órgano especial para la adaptación a la natación, pero no todos los peces tienen una vejiga natatoria (salmón).
Los microscopios se utilizan para detectar y estudiar microorganismos. Los microscopios ópticos están diseñados para estudiar microorganismos que tienen un tamaño de al menos 0,2 micrones (bacterias, protozoos, etc.) y los microscopios electrónicos para estudiar microorganismos más pequeños (virus) y las estructuras más pequeñas de bacterias.
Moderno microscopios de luz- Son dispositivos ópticos complejos, cuyo manejo requiere ciertos conocimientos, habilidades y gran precisión.
Los microscopios de luz se dividen en estudiantes, de trabajo, de laboratorio y de investigación, y difieren en diseño y óptica. Los microscopios domésticos (Biolam, Bimam, Mikmed) tienen designaciones que indican a qué grupo pertenecen (C - estudiante, R - trabajadores, L - laboratorio, I - investigación), el equipo se indica con un número.
Un microscopio se divide en partes mecánicas y ópticas.
A parte mecánica incluyen: un trípode (que consta de una base y un soporte de tubo) y un tubo montado en él con un revólver para montar y cambiar lentes, una mesa de objetos para la preparación, dispositivos para conectar un condensador y filtros de luz, así como mecanismos construidos en el trípode para grueso (macromecanismo, macrotornillo) y fino
(micromecanismo, microtornillo) para mover la plataforma del objeto o el soporte del tubo.
parte óptica El microscopio está representado por objetivos, oculares y un sistema de iluminación, que a su vez consiste en un condensador Abbe ubicado debajo de la platina del objeto, un espejo que tiene un lado plano y cóncavo, así como un iluminador separado o incorporado. Los objetivos se enroscan en el revólver y el ocular correspondiente, a través del cual se observa la imagen, se instala en el lado opuesto del tubo. Hay tubos monoculares (que tienen un ocular) y binoculares (que tienen dos oculares idénticos).
Diagrama esquemático del microscopio y sistema de iluminación.
1. Fuente de luz;
2. Colector;
3. Diafragma de campo del iris;
4. Espejo;
5. Diafragma de apertura del iris;
6. Condensador;
7. Droga;
7". Imagen intermedia real ampliada de la preparación, formada; por el objetivo;
7"". Imagen final virtual ampliada de la preparación, observada en el ocular;
8. Lente;
9. icono de lente de salida;
10. Apertura de campo del ocular;
11. Ocular;
12. Ojo.
Desempeña un papel importante en la adquisición de imágenes. lente. Construye una imagen ampliada, real e invertida del objeto. Luego, esta imagen se amplía aún más cuando se ve a través de un ocular que, de manera similar a una lupa convencional, proporciona una imagen virtual ampliada.
Aumento microscopio se puede determinar aproximadamente multiplicando el aumento del objetivo por el aumento del ocular. Sin embargo, la ampliación no determina la calidad de la imagen. La calidad de la imagen, su claridad, está determinada resolución del microscopio, es decir, la capacidad de distinguir por separado dos puntos muy próximos entre sí. Límite de resolución- la distancia mínima a la que estos puntos aún son visibles por separado - depende de la longitud de onda de la luz que ilumina el objeto y de la apertura numérica del objetivo. La apertura numérica, a su vez, depende de la apertura angular del objetivo y del índice de refracción del medio entre la lente frontal del objetivo y la preparación. La apertura angular es el ángulo máximo en el que los rayos que pasan a través de un objeto pueden entrar en la lente. Cuanto mayor sea la apertura y cuanto más cercano sea el índice de refracción del medio entre la lente y la preparación al índice de refracción del vidrio, mayor será la resolución de la lente. Si consideramos la apertura del condensador igual a la apertura del objetivo, entonces la fórmula de resolución tiene la siguiente forma:
donde R es el límite de resolución; - longitud de onda; NA - apertura numérica.
Distinguir útil y inútil aumento. El aumento útil suele ser igual a la apertura numérica del objetivo ampliada entre 500 y 1000 veces. Un mayor aumento ocular no saca a relucir nuevos detalles y es inútil.
Según el medio que se encuentre entre la lente y la preparación, existen lentes "secas" de pequeño y mediano aumento (hasta 40x) y lentes de inmersión de máxima apertura y aumento (90-100x). Una lente "seca" es una lente con aire entre la lente frontal y la muestra.
Una característica de las lentes de inmersión es que se coloca un líquido de inmersión entre la lente frontal de dicho objetivo y la preparación, que tiene un índice de refracción igual al del vidrio (o cercano a él), lo que asegura un aumento en la apertura numérica y la resolución. de la lente El agua destilada se usa como líquido de inmersión para lentes de inmersión en agua, y el aceite de cedro o un aceite de inmersión sintético especial se usa para lentes de inmersión en aceite. Es preferible el uso de aceite de inmersión sintético, ya que sus parámetros se normalizan con mayor precisión y, a diferencia del aceite de cedro, no se seca en la superficie de la lente frontal del objetivo. Para lentes que operan en la región ultravioleta del espectro, se usa glicerol como líquido de inmersión. En ningún caso debe utilizar sustitutos del aceite de inmersión y, en particular, del aceite de vaselina.
**La imagen obtenida con lentes tiene varias deficiencias: aberraciones esféricas y cromáticas, curvatura del campo de imagen, etc. En lentes formadas por varias lentes, estas deficiencias se corrigen en cierta medida. Según el grado de corrección de estas deficiencias, se distinguen lentes acromáticas y lentes apocromáticas más complejas. En consecuencia, las lentes en las que se corrige la curvatura del campo de la imagen se denominan acromáticos planos y apocromáticos planos. El uso de estas lentes produce una imagen nítida en todo el campo, mientras que la imagen obtenida con lentes convencionales no tiene la misma nitidez en el centro y en los bordes del campo de visión. Todas las características de la lente suelen estar grabadas en su montura: aumento propio, apertura, tipo de lente (APO - apocromática, etc.); las lentes de inmersión en agua tienen la designación VI y un anillo blanco alrededor del marco en su parte inferior, las lentes de inmersión en aceite tienen la designación MI y un anillo negro.
Todos los objetivos están diseñados para funcionar con un cubreobjetos de 0,17 mm.
El grosor del cubreobjetos afecta especialmente a la calidad de la imagen cuando se trabaja con sistemas secos fuertes (40x). Cuando se trabaja con objetivos de inmersión, no se deben utilizar cubreobjetos con un grosor superior a 0,17 mm porque el grosor del cubreobjetos puede ser mayor que la distancia de trabajo del objetivo, y en este caso, al intentar enfocar el objetivo sobre la muestra, el la lente frontal del objetivo puede estar dañada.
Los oculares constan de dos lentes y también vienen en varios tipos, cada uno de los cuales se usa con un tipo específico de lente, eliminando aún más las imperfecciones de la imagen. El tipo de ocular y su aumento están marcados en su montura.
El condensador está diseñado para enfocar la luz del iluminador sobre la preparación, dirigida por el espejo del microscopio o iluminador (en el caso de utilizar un iluminador adjunto o incorporado). Uno de los detalles del condensador es el diafragma de apertura, que es fundamental para la iluminación adecuada de la muestra.
El iluminador consta de una lámpara incandescente de bajo voltaje con un filamento grueso, un transformador, una lente colectora y un diafragma de campo, cuya apertura determina el diámetro del campo iluminado en la muestra. El espejo dirige la luz del iluminador al condensador. Para mantener el paralelismo de los haces provenientes del iluminador al condensador, es necesario utilizar únicamente el lado plano del espejo.
Ajuste de la iluminación y enfoque del microscopio.
La calidad de imagen también depende en gran medida de una iluminación adecuada. Hay varias formas diferentes de iluminar una muestra bajo el microscopio. La forma más común es instalaciones de iluminación según Köhler, que es el siguiente:
1) coloque el iluminador contra el espejo del microscopio;
2) encienda la lámpara iluminadora y dirija la luz hacia un espejo de microscopio plano (!);
3) colocar la preparación en la platina del microscopio;
4) cubra el espejo del microscopio con una hoja de papel blanco y enfoque la imagen del filamento de la lámpara moviendo el casquillo de la lámpara en el iluminador;
5) quitar una hoja de papel del espejo;
6) cerrar el diafragma de apertura del condensador. Moviendo el espejo y moviendo ligeramente el portalámparas, la imagen del filamento se enfoca en el diafragma de apertura. La distancia del iluminador al microscopio debe ser tal que la imagen del filamento de la lámpara sea igual al diámetro del diafragma de apertura del condensador (el diafragma de apertura se puede observar usando un espejo plano colocado en el lado derecho de la base del microscopio). ).
7) abrir el diafragma de apertura del condensador, reducir la apertura del diafragma de campo del iluminador y reducir significativamente la incandescencia de la lámpara;
8) a bajo aumento (10x), mirando por el ocular, se obtiene una imagen nítida de la preparación;
9) girando ligeramente el espejo, la imagen del diafragma de campo, que parece un punto brillante, se transfiere al centro del campo de visión. Bajando y subiendo el condensador, se logra una imagen nítida de los bordes del diafragma de campo en el plano de la preparación (se puede ver un borde coloreado alrededor de ellos);
10) abra el diafragma de campo del iluminador hasta los bordes del campo de visión, aumente la incandescencia del filamento de la lámpara y reduzca ligeramente (en 1/3) la apertura del diafragma de apertura del condensador;
11) Al cambiar la lente, debe verificar la configuración de la luz.
Después de completar el ajuste de la luz según Koehler, es imposible cambiar la posición del condensador y la apertura de los diafragmas de campo y apertura. La iluminación de la preparación solo se puede ajustar con filtros de luz neutra o cambiando la incandescencia de la lámpara usando un reóstato. Una apertura excesiva del diafragma de apertura del condensador puede provocar una disminución significativa del contraste de la imagen, y una apertura insuficiente puede provocar un deterioro significativo de la calidad de la imagen (aparición de anillos de difracción). Para comprobar la correcta apertura del diafragma de apertura, es necesario quitar el ocular y, mirando dentro del tubo, abrirlo de manera que cubra un tercio del campo luminoso. Para una correcta iluminación de la preparación, cuando se trabaja con lentes de bajo aumento (hasta 10x), es necesario desenroscar y retirar la lente superior del condensador.
¡Atención! Cuando se trabaja con lentes que dan gran aumento - con sistemas de secado fuerte (40x) y de inmersión (90x), para no dañar la lente frontal, al enfocar utilizan la siguiente técnica: observando de lado, bajar la lente con un macrotornillo casi hasta que entre en contacto con la preparación, luego, mirando por el ocular, el macrotornillo levanta muy lentamente el lente hasta que aparece la imagen, y con la ayuda del microtornillo se realiza el enfoque final del microscopio.
Cuidado del microscopio
Cuando trabaje con un microscopio, no haga un gran esfuerzo. No toque las superficies de lentes, espejos y filtros con los dedos.
Para proteger del polvo las superficies internas de los objetivos, así como los prismas del tubo, debe dejar siempre el ocular en el tubo. Cuando limpie las superficies exteriores de las lentes, elimine el polvo con un cepillo suave lavado con éter. Si es necesario, limpie con cuidado las superficies de las lentes con un paño de lino o batista bien lavado y sin jabón, ligeramente humedecido con gasolina limpia, éter o una mezcla especial para limpiar ópticas. No se recomienda limpiar la óptica de la lente con xileno, ya que esto puede hacer que se pegue.
De los espejos con plateado externo, solo puede eliminar el polvo soplándolo con una perilla de goma. No puedes borrarlos. También es imposible desatornillar y desmontar las lentes usted mismo; esto provocará su daño. Una vez finalizado el trabajo en el microscopio, es necesario eliminar con cuidado los restos de aceite de inmersión de la lente frontal del objetivo de la manera descrita anteriormente. Luego baje la platina (o condensador en microscopios con platina fija) y cubra el microscopio con una tapa.
Para preservar la apariencia del microscopio, es necesario limpiarlo periódicamente con un paño suave ligeramente empapado en vaselina sin ácido y luego con un paño seco, suave y limpio.
Además de la microscopía óptica convencional, existen métodos de microscopía que le permiten estudiar microorganismos no teñidos: contraste de fase , campo oscuro y luminiscente microscopía. Para estudiar microorganismos y sus estructuras, cuyo tamaño es menor que la resolución de un microscopio óptico, utilice
microscopía de luz
El microscopio óptico, el principal instrumento de la biología, es un sistema óptico que consta de un condensador y un objetivo. El haz de luz de la fuente de luz se recoge en un condensador y se dirige al objeto (Fig. 1). Después de atravesar el objeto, los rayos de luz ingresan al sistema de lentes del objetivo; construyen la imagen principal, que se amplía con las lentes del ocular. La parte óptica principal del microscopio, que determina sus capacidades principales, es la lente. En los microscopios modernos, las lentes son intercambiables, lo que le permite estudiar células con diferentes aumentos. La principal característica de un microscopio como sistema óptico es su resolución. Las imágenes proporcionadas por la lente se pueden ampliar muchas veces utilizando un ocular potente o, por ejemplo, proyectándolas en una pantalla (hasta 105 veces). Se calcula que la resolución de la lente, es decir, la distancia mínima entre dos puntos que son visibles por separado será igual a
¿donde? es la longitud de onda de la luz utilizada para iluminar el objeto; n es el índice de refracción del medio; ? - el ángulo entre el eje óptico de la lente y el haz más desviado que entra en la lente. La resolución de un microscopio depende de la longitud de onda: cuanto menor es, menor es el detalle que podemos ver, y de la apertura numérica del objetivo (n sen ?), cuanto mayor es, mayor es la resolución. Normalmente, los microscopios ópticos utilizan fuentes de luz en la región visible del espectro (400-700 nm), por lo que la resolución máxima del microscopio en este caso no puede ser superior a 200-350 nm (0,2-0,35 micras). Si se utiliza luz ultravioleta (260-280 nm), la resolución se puede aumentar a 130-140 nm (0,13-0,14 µm). Este será el límite de la resolución teórica del microscopio óptico, determinado por la naturaleza ondulatoria de la luz. Así, todo lo que puede dar un microscopio óptico como dispositivo auxiliar a nuestro ojo es aumentar su resolución unas 1000 veces (el ojo humano desnudo tiene una resolución
capacidad es de aproximadamente 0,1 mm, lo que equivale a 100 micras). Este es el aumento "útil" del microscopio, por encima del cual solo aumentaremos los contornos de la imagen sin revelar nuevos detalles en ella. Por lo tanto, cuando se usa la región visible de la luz, 0,2-0,3 µm es el límite máximo de resolución del microscopio óptico.
Pero aun así, en un microscopio óptico, se pueden ver partículas de menos de 0,2 micrones. Este es el método de "campo oscuro" o, como solía llamarse, el método de "ultramicroscopía". Su esencia es que, como partículas de polvo en un haz de luz (efecto Tyndall), partículas diminutas (menos de 0,2 micrones) brillan en una celda bajo iluminación lateral, cuya luz reflejada ingresa a la lente del microscopio. Este método se ha utilizado con éxito en el estudio de células vivas.
Si las células vivas o muertas no tratadas se ven con luz transmitida, solo se distinguen grandes detalles en ellas debido al hecho de que tienen un índice de refracción y absorción de rayos de luz diferente al del medio ambiente. Grande
algunos de los componentes celulares difieren poco en estas propiedades tanto del medio (agua o soluciones tisulares) como entre sí y, por lo tanto, apenas se notan y no contrastan. Para estudiarlos, uno tiene que cambiar la iluminación (mientras se pierde la claridad de la imagen) o aplicar métodos y dispositivos especiales. Uno de estos métodos es la microscopía de contraste de fase, que se usa ampliamente para observar células vivas. Se basa en el hecho de que las secciones individuales de una celda generalmente transparente, aunque ligeramente, aún difieren entre sí en densidad y refracción de la luz. Al pasar a través de ellos, la luz cambia de fase, pero nuestro ojo no capta tal cambio en la fase de la onda de luz, ya que solo es sensible a los cambios en la intensidad de la luz. Este último depende de la amplitud de la onda de luz. En un microscopio de contraste de fase, se monta una placa especial en la lente, a través de la cual el haz de luz experimenta un cambio de fase adicional de oscilaciones. Al construir una imagen, los rayos que ya están interactuando
en una fase o en antifase, pero con diferentes amplitudes; esto crea una imagen de contraste claro-oscuro del objeto.
Una técnica similar se utiliza en el microscopio de interferencia. Está diseñado para que un haz de rayos de luz paralelos del iluminador se divida en dos corrientes. Uno de ellos atraviesa el objeto y adquiere cambios en la fase de oscilación, el otro pasa por alto el objeto. En los prismas del objetivo, ambas corrientes se reconectan e interfieren entre sí. Como resultado de la interferencia, se construirá una imagen en la que las secciones de la celda con diferentes espesores o diferentes densidades se diferenciarán entre sí en términos de contraste. En este dispositivo, al medir los cambios de fase, es posible determinar la concentración y la masa de materia seca en el objeto.
Con la ayuda de un microscopio polarizador, se estudian objetos que tienen la llamada isotropía, es decir, orientación ordenada de partículas submicroscópicas (por ejemplo, fibras del huso de fisión, miofibrillas, etc.). En tal microscopio, frente al condensador.
se coloca un polarizador que transmite ondas de luz con cierto plano de polarización. Después de la preparación y la lente, se coloca un analizador, que puede transmitir luz con el mismo plano de polarización. El polarizador y el analizador son prismas hechos de espato islandés (prismas Nicol). Si el segundo prisma (analizador) se gira 90o con respecto al primero, entonces no pasará luz. En el caso de que haya un objeto con birrefringencia entre dichos prismas cruzados, es decir la capacidad de polarizar la luz, se verá brillando en un campo oscuro. Usando un microscopio polarizador, se puede verificar, por ejemplo, la disposición orientada de las micelas en la pared celular de la planta.
Estudio vital (de por vida) de las células
Un microscopio de luz le permite ver células vivas. Para la observación a corto plazo, las células simplemente se colocan en un medio líquido en un portaobjetos de vidrio; si necesita una observación a largo plazo de las células, entonces
Se utilizan cámaras especiales. Estos son botellas planas con agujeros cubiertos con vasos delgados o cámaras planas plegables. Como objetos, se pueden utilizar células de vida libre de protozoos y otros organismos unicelulares, células sanguíneas o células tisulares disociadas de organismos multicelulares de origen tanto animal como vegetal. En cualquiera de estos casos, las células se estudian en medios especialmente seleccionados. Los organismos unicelulares de vida libre se consideran y estudian en los mismos ambientes en los que viven en condiciones naturales o se cultivan en el laboratorio. Así, para algunos protozoos se han creado entornos artificiales en los que crecen y se multiplican. Normalmente se trata de soluciones salinas equilibradas con adiciones de microorganismos u otros protozoos que sirven de alimento a este tipo de organismos.
Las células sanguíneas u otras células libres de organismos multicelulares pueden estudiarse en una gota de plasma o en medios sintéticos especiales.
Para estudiar las células de los órganos y tejidos de los animales,
método de cultivo celular. Una versión más simple de este método es que se coloca una pequeña pieza de tejido vivo en una cámara llena de un medio nutritivo (una mezcla de plasma sanguíneo con un extracto embrionario o una mezcla de un medio sintético con la adición de plasma sanguíneo). Después de un tiempo, la división celular y el crecimiento comienzan en la periferia de dicha pieza. En otro caso, el trozo de tejido cortado se trata ligeramente con una solución de la enzima tripsina o helaton - versen, lo que conduce a su disociación, a la separación completa de las células entre sí. Luego, dicha suspensión de células lavadas se coloca en un recipiente con un medio nutritivo, donde se hunden hasta el fondo, se adhieren al vaso y comienzan a multiplicarse, formando primero colonias y luego una capa celular continua. Así es como crecen los cultivos celulares de una sola capa, que son muy convenientes para las observaciones in vivo. Lo mejor es utilizar material embrionario para obtener cultivos primarios a partir de tejidos animales; los cultivos de células de organismos adultos crecen muy mal.
Cuando se cultivan células fuera del cuerpo, además de cambiar el medio, es importante mantener la temperatura requerida (alrededor de 20° para sangre fría y alrededor de 37° para sangre caliente). Un requisito previo para el cultivo celular es la esterilidad. Hay una serie de células cultivadas a largo plazo; Estas son cepas de células especiales que se han adaptado durante décadas al crecimiento fuera del cuerpo. En su mayor parte, estas son células de origen tumoral o células significativamente alteradas que han adquirido las propiedades de las células tumorales.
Ahora, el método de cultivo de células fuera del cuerpo se usa ampliamente no solo para estudios citológicos, sino también genéticos, virológicos y bioquímicos.
Las células vegetales también se pueden cultivar en cultivo. Para ello, se tratan trozos de tejido con enzimas que disuelven las membranas celulares. Los cuerpos celulares separados, los protoplastos, se colocan en un medio de cultivo donde se dividen y forman zonas de células multiplicadas.
Las observaciones en células vivas generalmente se registran como
Fotografías tomadas con accesorios especiales de microscopio. También se pueden filmar células vivas. En algunos casos, tal microfilmación proporciona información muy importante. Mediante filmaciones a cámara lenta o acelerada (filmación time-lapse), se puede ver en detalle el curso de procesos tan importantes como la división celular, la fagocitosis, el flujo del citoplasma, el batido de los cilios, etc.
Ahora, con el desarrollo de la tecnología informática, con la ayuda de cámaras de televisión especiales, es posible obtener una imagen de las células directamente en un monitor de computadora, grabarlas en la memoria de la computadora, procesarlas de todas las formas posibles y recibir impresiones en color. o impresoras en blanco y negro. También es posible utilizar este tipo de equipo de vídeo por ordenador para filmar a intervalos de tiempo objetos en movimiento.
En el estudio de células vivas, se utilizan métodos de microcirugía e intervención quirúrgica en células. Con la ayuda de un dispositivo micromanipulador, se cortan las células, se extraen partes de ellas, se inyectan sustancias (microinyección), etc. El micromanipulador se combina con un convencional
microscopio en el que se observa el progreso de la operación. Los instrumentos microquirúrgicos son ganchos de vidrio, agujas, capilares, que tienen dimensiones microscópicas y están hechos en dispositivos especiales: "microforjas". Durante la micromanipulación, las células se colocan en cámaras especiales, en las que también se insertan instrumentos. Entonces, con la ayuda de un micromanipulador, fue posible trasplantar núcleos de una cepa de ameba a otra y probar que es el núcleo celular el que determina las características fisiológicas de la célula en su conjunto. Con la ayuda de un micromanipulador, fue posible inyectar oro coloidal en una célula de ameba y luego estudiar la distribución de sus partículas en el citoplasma y el núcleo.
Con la ayuda de tales instrumentos microquirúrgicos, es posible convertir los husos mitóticos en las células, extraer cromosomas individuales e introducir anticuerpos marcados o varias moléculas de proteínas en una célula viva. Además del efecto mecánico sobre las células en la microcirugía, recientemente se han utilizado ampliamente los microhaces ultravioleta.
microhaces de luz o láser. Esto hace posible inactivar casi instantáneamente partes individuales de una célula viva. Así, por ejemplo, es posible inactivar uno de los nucléolos y seguir el destino del segundo, intacto. En este caso, se muestra que el segundo nucléolo asume una carga adicional y "funciona para dos". Con la ayuda de microhaces, es posible alcanzar una parte del cromosoma mitótico o una sección del huso de división. Resultó que el daño al centrómero del cromosoma elimina a este último del proceso de divergencia de los cromosomas a los polos de la célula durante la mitosis. Recientemente, se han utilizado dispositivos con un microhaz láser, lo que permite dosificar con mucha precisión la cantidad de energía en el punto de la lesión y utilizar pulsos de radiación muy cortos (nanosegundos).
Al estudiar las células vivas, intentan teñirlas con la ayuda de los llamados tintes vitales. Son colorantes de naturaleza ácida (azul de tripano, carmín de litio), utilizados a una dilución muy alta (1:200.000), por lo tanto,
la influencia del tinte en la actividad vital de la célula es mínima. Al teñir células vivas, el tinte se acumula en el citoplasma en forma de gránulos, mientras que en las células dañadas o muertas se produce una tinción difusa del citoplasma y el núcleo.
En el estudio de células vivas, se utilizan ampliamente colorantes fluorescentes y microscopía de fluorescencia. Su esencia radica en el hecho de que una serie de sustancias tienen la capacidad de brillar (fluorescencia, luminiscencia) cuando absorben energía luminosa. El espectro de fluorescencia siempre se desplaza hacia longitudes de onda más largas con respecto a la radiación que excita la fluorescencia. Entonces, por ejemplo, la clorofila aislada brilla en rojo cuando se ilumina con rayos ultravioleta. Este principio se utiliza en microscopía de fluorescencia: visualización de objetos fluorescentes en la zona de longitud de onda corta. Por lo general, estos microscopios utilizan filtros que proporcionan iluminación en la región azul-violeta. Hay microscopios de fluorescencia ultravioleta.
Algunos pigmentos (clorofilas, pigmentos bacterianos), vitaminas (A y B2), hormonas tienen su propia fluorescencia. Si examinamos las células vegetales con un microscopio fluorescente, entonces, contra un fondo azul oscuro, se verán granos rojos que brillan intensamente dentro de la célula: estos son cloroplastos.
La microscopía de fluorescencia se puede usar agregando fluorocromos (sustancias fluorescentes) a las células vivas. Este método es similar a la tinción vital en el sentido de que aquí también se utilizan concentraciones de colorante muy bajas (1 x 10-4–1 x 10-5). Muchos fluorocromos se unen selectivamente a ciertas estructuras celulares, provocando su luminiscencia secundaria. Por ejemplo, el fluorocromo naranja de acridina se une selectivamente a los ácidos nucleicos. Además, cuando se une en la forma monomérica con el ADN, emite fluorescencia en verde, y en la forma dimérica con el ARN, brilla en rojo. Al observar las células vivas teñidas con naranja de acridina, es claro que sus núcleos tienen un brillo verde y el citoplasma
y los nucléolos brillan en rojo. Así, en una célula viva, usando este método, se puede ver la localización (y en algunos casos calcular la cantidad) de ciertos químicos. Hay fluorocromos que se unen selectivamente a lípidos, mocos, queratina, etc.
Los anticuerpos marcados con fluorocromo también se pueden inyectar en células vivas. Por ejemplo, los anticuerpos unidos a fluorocromos contra la proteína tubulina introducida en una célula se unen a los microtúbulos, que ahora se pueden observar en células vivas con un microscopio fluorescente.
Recientemente, una combinación de microscopía de luz (especialmente contraste de fase) con procesamiento de imágenes por computadora electrónica ha comenzado a usarse ampliamente para estudiar células vivas o sus componentes. En este caso, se utiliza una grabación de video con procesamiento electrónico de imágenes que, por así decirlo, "elimina" los niveles de fondo y resalta y contrasta las estructuras observadas. Esta técnica le permite ver tales estructuras en una pantalla de televisión.
como microtúbulos, cuyo tamaño (20 nm) es mucho más pequeño que el poder de resolución de un microscopio óptico. El uso de tales sistemas no solo reemplaza la filmación de lapso de tiempo, en lugar de la grabación de video, sino que también permite el procesamiento de la imagen por computadora: información sobre la densidad de las estructuras, sus parámetros, el número y la organización tridimensional. En combinación con la microscopía de fluorescencia, estos métodos abren grandes perspectivas en el estudio de las células vivas.
Los métodos convencionales de microscopía óptica son difíciles de usar para reproducir una imagen tridimensional del objeto bajo estudio debido a la pequeña profundidad de campo del microscopio. Las celdas generalmente se ven como secciones ópticas a una profundidad de foco determinada. Para obtener una reconstrucción tridimensional completa del objeto, se utiliza un microscopio de luz de barrido confocal especial. Con la ayuda de este aparato se obtienen una serie de sucesivas secciones ópticas, tomadas desde diferentes profundidades y cuyas imágenes se acumulan en un ordenador, y según un especial
El programa reconstruye una imagen tridimensional, tridimensional de un objeto. Por lo general, se utilizan objetos teñidos con fluorocromos.
Estudio de células fijas
A pesar de la importancia y sencillez de las observaciones vitales, la mayor parte de la información sobre la estructura y propiedades de las células se ha obtenido utilizando material fijo. Si la célula está dañada, comienza a sufrir una serie de cambios y, después de la muerte de la célula, se activan enzimas autolíticas en ella, lo que conduce a cambios importantes en la estructura celular. Por lo tanto, las tareas de la fijación son matar la célula, detener la actividad de las enzimas intracelulares, prevenir la descomposición de los componentes celulares y también evitar la pérdida de estructuras y sustancias, y prevenir la aparición de estructuras que están ausentes en una célula viva ( estructuras de artefactos). Desafortunadamente, todavía no se ha encontrado ningún fijador químico que satisfaga todos estos requisitos.
Los aldehídos y sus mezclas con otras sustancias se utilizan a menudo para la fijación. Los alcoholes también se utilizan como fijadores.
causando desnaturalización irreversible de proteínas, precipitación de ácidos nucleicos y polisacáridos. Los fijadores sublimados y los fijadores con ácido pícrico tienen un efecto precipitante. Los fijadores que contienen tetróxido de osmio (OsO4) conservan bien los lípidos.
Después de la reparación, los objetos pueden someterse a un procesamiento adicional en el futuro. Uno de los principales tratamientos de este tipo es la tinción celular. Fue la tinción adicional de las células lo que permitió revelar muchos detalles en ellas.
Los portaobjetos con frotis fijados de organismos unicelulares o con células de cultivo de tejidos se pueden colocar directamente en las tinciones. Pero para teñir las células en la composición de los órganos, es necesario obtener sus secciones. Se estudian tales secciones y celdas individuales.
Para hacer esto, después de la fijación, las partes de los órganos se deshidratan en alcoholes de concentración creciente, el alcohol se reemplaza por xileno y el xileno se reemplaza por parafina. Así, el tejido fijado, evitando el secado por aire, se encapsula en una masa sólida de parafina, que se puede cortar.
Las secciones de hasta 5-10 micrones de espesor se obtienen en un dispositivo especial: un micrótomo. Dichas secciones se pegan a un portaobjetos de vidrio: la parafina se disuelve en xileno, el xileno se elimina con alcoholes, que se reemplazan por agua. Las secciones ahora se pueden teñir con soluciones acuosas de tinte. Para hacer preparaciones permanentes, las secciones teñidas se deshidratan nuevamente y se incrustan en bálsamo canadiense bajo un cubreobjetos; estas preparaciones se pueden almacenar durante mucho tiempo.
Se utilizan varios tintes naturales y principalmente sintéticos para teñir células y tejidos fijados. Los colorantes naturales (hematoxilina, carmín, etc.) se utilizan en combinación con mordientes (óxidos de varios metales), con los que forman compuestos complejos (barnices).
Los tintes sintéticos se dividen en ácidos y básicos. Las pinturas básicas son sales de bases colorantes que contienen en su composición grupos amino, que determinan su alcalinidad. Estos colorantes forman enlaces salinos con
grupos ácidos en las estructuras celulares. En consecuencia, las áreas de células ricas en grupos ácidos se unirán a colorantes básicos, serán, como se les llama, basófilas. Los colorantes ácidos contienen grupos hidroxilo o grupos SO2OH. Las estructuras celulares con propiedades básicas (alcalinas) se unen a tintes ácidos y se denominan acido u oxifílicas. Hay muchas mezclas de tales tintes que pueden teñir simultáneamente diferentes partes de las células en diferentes colores y, por lo tanto, aumentar el contraste de los componentes celulares y extracelulares. Por lo tanto, utilizando varios tintes, los investigadores no solo logran una imagen morfológica clara de la célula, sino que también obtienen información sobre la química de una estructura particular.
Una serie de técnicas coloridas destinadas a identificar sustancias químicas específicas se denominan histoquímicas y citoquímicas. Hay muchos métodos de análisis citoquímico.
Hay una serie de técnicas de color específicas, directamente
detectar ciertas sustancias. Estas son en realidad reacciones histoquímicas (citoquímicas). Los requisitos principales para tales reacciones son los siguientes: la especificidad de la unión del tinte, la inmutabilidad de la localización de la sustancia.
Un ejemplo de este tipo de reacciones citoquímicas puede ser una reacción ampliamente utilizada para el ADN, la reacción de Feulgen (Fig. 8). Su esencia es que después de la hidrólisis ácida específica solo en el ADN, como resultado de la escisión de las purinas en la desoxirribosa, se forman grupos aldehído. Estos grupos pueden reaccionar con un indicador específico, el reactivo de Schiff (base de fucsina decolorada), dando una tinción roja en los sitios de localización del ADN. La unión del tinte en este caso es estrictamente cuantitativa, lo que permite no solo detectar e indicar los lugares donde hay ADN, sino también medir su cantidad. Utilizando el mismo principio de identificación de grupos aldehído, se puede ver la ubicación de los polisacáridos en las células después de su hidrólisis con ácido peryódico (la llamada reacción PAS).
También es posible determinar específicamente la localización de proteínas mediante reacciones a aminoácidos individuales (tirosina, triptófano, arginina, etc.). Los lípidos y las grasas se detectan en las células con tintes especiales (negro de Sudán), que se disuelven bien y se acumulan en inclusiones grasas.
Todo un grupo de reacciones citoquímicas está asociado con la detección de enzimas. El principio general de estas reacciones es que no son las enzimas proteicas mismas las que son visibles bajo un microscopio, sino los lugares de su localización, que son detectados por los productos de su actividad enzimática específica.
La cantidad del producto final de la reacción citoquímica se puede determinar utilizando el método de citofotometría. Se basa en determinar la cantidad de sustancias químicas por su absorción de luz de una cierta longitud de onda. Se encontró que la intensidad de absorción de los rayos es proporcional a la concentración de la sustancia en el mismo espesor del objeto. Por lo tanto, al estimar el grado de absorción de luz por parte de una sustancia determinada, se puede averiguar su cantidad. Para este tipo de investigación,
dispositivos - microscopios-citofotómetros; tienen un fotómetro sensible detrás de la lente, que registra la intensidad del flujo de luz que pasa a través del objeto. Conociendo el área o volumen de la estructura medida y el valor de absorción, es posible determinar tanto la concentración de una sustancia dada como su contenido absoluto. El método de citofotometría se usa ampliamente para determinar la cantidad de ADN por célula después de la reacción de Feulgen. En este caso, no es el propio ADN lo que se fotométrica, sino el contenido de fucsina de color rojo, cuya cantidad es directamente proporcional al contenido de ADN. Al comparar los valores de absorbancia obtenidos con los estándares, es posible obtener valores exactos de la cantidad de ADN, expresados en gramos. Este método permite medir la cantidad de ADN hasta 10-12 - 10-14 g, mientras que los métodos microquímicos tienen una sensibilidad de no más de 10-6 g Mediante la citofotometría, el contenido de ADN en las células se determina con mucha más precisión que la bioquímica convencional. métodos.
No solo absorbe la luz
objetos y sustancias, pero también radiantes (luminosos). Así, se han desarrollado métodos de fluorometría cuantitativa que permiten determinar el contenido de sustancias con las que se unen los fluorocromos por el grado de luminiscencia.
Para identificar proteínas específicas, se utilizan reacciones inmunoquímicas que utilizan anticuerpos fluorescentes. Este método de inmunofluorescencia tiene una especificidad y sensibilidad muy altas. Puede usarse para identificar no solo proteínas, sino también secuencias de nucleótidos individuales en el ADN o para determinar la localización de moléculas híbridas de ARN-ADN. Para ello, primero se obtienen sueros que contienen anticuerpos específicos para una proteína (por ejemplo, la tubulina). Los anticuerpos purificados se acoplan químicamente a los fluorocromos. Estas preparaciones se vierten sobre objetos y, usando un microscopio fluorescente, las ubicaciones de las proteínas deseadas en la célula se encuentran mediante la fluorescencia del fluorocromo. Sin embargo, para que los anticuerpos marcados con fluorocromos entren en la célula, se requiere una membrana plasmática.
hacerlo permeable. Esto generalmente se logra mediante la fijación celular y la extracción parcial de lípidos de las membranas. Para estudiar las proteínas del citoesqueleto con este método, se recurre a la disolución de las membranas celulares con varios detergentes.
Para determinar la localización de los sitios para la síntesis de biopolímeros, para determinar las vías para la transferencia de sustancias en la célula, para monitorear la migración o las propiedades de las células individuales, el método de autorradiografía es ampliamente utilizado: el registro de sustancias marcadas con isótopos. (Figura 9). El principio de este método es muy simple, repite el método de Becquerel, quien descubrió la desintegración radiactiva. En el examen radioautográfico, las células se introducen en el medio con un precursor de uno de los compuestos macromoleculares (por ejemplo, un aminoácido o un nucleótido), uno de cuyos átomos se reemplaza por un isótopo radiactivo. Por ejemplo, en lugar de 12C, se introduce un átomo de 14C, en lugar de hidrógeno, tritio 3H, etc. En el proceso de síntesis, la molécula precursora marcada también se incluirá en el biopolímero. registrar su lugar
en una jaula es posible por medio de una emulsión fotográfica. Si las células en la capa o en el corte se cubren con una emulsión fotográfica, luego de un tiempo, como resultado de la descomposición del isótopo, las partículas que vuelan al azar en diferentes direcciones caerán en la zona de la fotocapa sensible y activarán la plata. granos de bromuro en él. Cuanto mayor sea el tiempo de exposición, es decir, contacto de una célula marcada de este tipo con una emulsión fotográfica, se expondrán más granos de AgBr. Después de la exposición, es necesario revelar la preparación; en este caso, la plata se reduce solo en los gránulos iluminados; cuando la preparación se fija, los gránulos de AgBr no expuestos se disuelven. Como resultado, de la masa de gránulos que cubría el objeto, solo quedarán aquellos que fueron activados por la radiación. Mirando a través del microscopio tales preparaciones, sobre las cuales se aplica una capa de emulsión fotográfica, el investigador encuentra la localización de granos de plata, que se encuentran frente a los lugares donde se encuentra la sustancia marcada (Fig. 9).
Este método tiene limitaciones: su precisión dependerá
sobre el tamaño de grano de AgBr y sobre la energía de la partícula. Cuanto mayor es el tamaño del grano, menos precisa es la ubicación del isótopo. Y cuanto mayor sea la energía de la partícula y más larga sea su trayectoria, más lejos del lugar de descomposición se producirá la activación de los granos de AgBr. Por lo tanto, para el método de autorradiografía se utilizan emulsiones fotográficas especiales de grano fino (0,2-0,3 μm) e isótopos con partículas de baja energía, principalmente el isótopo de hidrógeno, tritio (3H). Cualquier precursor de macromoléculas biológicas puede marcarse con tritio: nucleótidos, aminoácidos, azúcares, ácidos grasos. Para estudios radioautográficos también se utilizan hormonas marcadas, antibióticos, inhibidores, etc.. Los compuestos hidrosolubles no pueden estudiarse mediante autorradiografía, ya que pueden perderse durante el tratamiento de las células con soluciones acuosas (fijación, manifestación, etc.). Otra limitación del método es una concentración bastante alta de estas sustancias, ya que a una concentración baja de una sustancia radiactiva, el tiempo de exposición aumenta, mientras que
el peligro de la aparición de un fondo de gránulos de AgBr iluminados debido a la radiación cósmica.
El método de autorradiografía es uno de los principales métodos que permite estudiar la dinámica de los procesos sintéticos, para comparar su intensidad en diferentes células en la misma preparación. Por ejemplo, utilizando este método, utilizando precursores de ARN marcados, se demostró que todo el ARN se sintetiza solo en el núcleo en interfase, y la presencia de ARN citoplasmático es el resultado de la migración de moléculas sintetizadas desde el núcleo.
El método de autorradiografía también se usa para determinar la ubicación de ciertos tipos de ácidos nucleicos o secuencias de nucleótidos individuales en la composición de núcleos celulares o cromosomas: el método de hibridación molecular. Para ello, se aplica una solución con un ácido nucleico marcado (por ejemplo, con ARN ribosómico) o con su fragmento (por ejemplo, con ADN satélite) sobre una preparación pretratada para desnaturalizar el ADN (romper puentes de hidrógeno en nativos). ADN) en la composición
cromosomas o núcleos, lo que se consigue mediante un tratamiento alcalino o térmico de la muestra. En el proceso de renaturalización del ADN, se forma un híbrido molecular entre el ácido nucleico marcado de la solución y su región de ADN complementaria en la preparación. El lugar de tal hibridación se determina radioautográficamente. Este método de hibridación molecular de ácidos nucleicos permite localizar lugares con una secuencia de nucleótidos dada en un cromosoma o incluso la ubicación de ciertos genes con gran precisión.
El método de hibridación molecular de ácidos nucleicos también se usa al teñirlos con fluorocromos. Por ejemplo, si el ADN nucleolar aislado responsable de la síntesis del ARN ribosomal se une preliminarmente a algún fluorocromo, luego de la renaturalización del ADN en preparaciones con este ADN ribosomal fluorescente, se puede ver que la fluorescencia se observará solo en los nucléolos de las células en interfase o sólo en las zonas organizadoras nucleolares de los cromosomas mitóticos. De este modo
es posible localizar cualquier secuencia de ADN en las células e incluso la ubicación en los núcleos de los cromosomas individuales. Esta técnica se denomina método FISH (hibridación fluorescente in situ).
microscopio de electrones
Teniendo en cuenta las características de un microscopio óptico, uno puede estar convencido de que la única forma de aumentar la resolución de un sistema óptico es utilizar una fuente de iluminación que emita ondas con la longitud de onda más corta. Tal fuente puede ser un filamento caliente, que en un campo eléctrico expulsa una corriente de electrones, estos últimos pueden ser enfocados al pasar a través de un campo magnético. Esto sirvió de base para la creación de un microscopio electrónico, en el que ya se ha conseguido una resolución de 1 A (0,1 nm). Según el principio de construcción, un microscopio electrónico es muy similar a uno óptico: tiene una fuente de iluminación (cátodo de cañón de electrones), un sistema condensador (lente magnética condensadora), un objetivo (lente magnética objetivo), un ocular (cámara de proyección). lentes magnéticas), pero en lugar de
En la retina del ojo, los electrones caen sobre una pantalla luminiscente o sobre una placa fotográfica (Fig. 7).
La parte principal de dicho microscopio es un cilindro hueco (columna de microscopio), desde el cual se bombea aire para que no haya interacción de electrones con moléculas de gas y oxidación del filamento de tungsteno en el cátodo del cañón de electrones. Se aplica un alto voltaje (de 50 a 200-5000 kV) entre el cátodo y el ánodo, lo que hace que los electrones se aceleren. Hay un agujero en el centro del ánodo, a través del cual los electrones forman un haz que baja por la columna del microscopio. Las lentes de un microscopio electrónico son electroimanes cuyo campo puede cambiar la trayectoria de los electrones (como las lentes de vidrio cambian la trayectoria de los fotones). En una lente de condensador, un haz de electrones se fija y golpea un objeto con el que los electrones interactúan, se desvían, se dispersan, se absorben o pasan sin cambios. Los electrones que pasan a través del objeto son enfocados por una lente objetivo, que forma
imagen primaria ampliada del objeto. Al igual que en un microscopio óptico, la lente del objetivo determina sus indicadores principales. La imagen principal se amplía con una lente de proyección y se proyecta en una pantalla cubierta con una capa luminiscente que brilla cuando los electrones la golpean. En lugar de una pantalla luminosa, la imagen se puede colocar en una placa fotográfica y se puede obtener una imagen.
El voltaje utilizado para acelerar los electrones en la mayoría de los microscopios electrónicos de transmisión (transmisión) alcanza los 50-150 kV. A un voltaje de 50 kV, un electrón tiene una longitud de onda de 0,05 A, y en este caso, teóricamente, podría obtenerse una resolución de 0,025 A (d ~ 0,5?). Sin embargo, en los diseños modernos de microscopios electrónicos, se logra una resolución de alrededor de 1 A debido a la estabilidad de voltaje insuficiente, la estabilidad de corriente de la lente, la falta de homogeneidad del metal de las lentes magnéticas y otras imperfecciones del dispositivo (teóricamente, es posible aumentar aún más la resolución de un microscopio electrónico
100 veces). Pero la resolución conseguida también es enorme (recordemos que el valor del enlace О-Н en una molécula de agua es de 0,99 A): ¡ya es 106 veces superior a la resolución del ojo!
En las pantallas y placas fotográficas de los microscopios electrónicos, se pueden obtener aumentos de hasta 50.000 veces, luego se pueden obtener otros 10 aumentos con la impresión de fotografías, de modo que el aumento final, en el que se maximiza la resolución, puede llegar a 106 veces (por ejemplo, si 1 mm se aumenta 106 veces, entonces alcanzará una longitud de 1 km).
En la actualidad, una imagen de microscopía electrónica de una pantalla fluorescente se transmite directamente a una computadora mediante una cámara de televisión digital, donde se puede procesar en la pantalla del monitor de varias maneras (cambiando la ampliación, el contraste de la imagen, aplicando densitometría, planimetría y morfometría de individuos). componentes). Usando la impresora, puede obtener copias de las imágenes recibidas.
La resolución máxima de un microscopio electrónico (EM) se realiza
ahora solo en el estudio de metales o redes cristalinas. Hasta el momento, no ha sido posible obtener tal resolución en objetos biológicos debido al bajo contraste del objeto. Los objetos biológicos para el estudio en EM se colocan en rejillas de cobre recubiertas con películas delgadas: sustratos (formvar, colodión, carbono), que consisten principalmente en carbono. Los objetos biológicos también contienen principalmente carbono y, por lo tanto, diferirán poco en densidad del fondo, tendrán poco contraste. Se muestra que el espesor mínimo de un objeto biológico con una densidad de aproximadamente 1 g/cm3, detectado a un voltaje de aceleración en un microscopio electrónico de 50 kV, es de 50 A. Los virus ubicados en la película de soporte serán visibles en este caso. en forma de manchas sin estructura, y las moléculas de ácido nucleico (el grosor del ADN es de 20 A) no son visibles en absoluto debido al bajo contraste. El contraste de los objetos biológicos se puede aumentar utilizando metales pesados o sus sales.
Objetos corpusculares contrastantes
Los objetos corpusculares pueden llamarse partículas de virus, fagos, componentes celulares aislados (ribosomas, membranas, vacuolas, etc.), macromoléculas.
Uno de los métodos más utilizados para contrastar objetos biológicos es el sombreado metálico. En este caso, la evaporación térmica del metal se realiza en instalaciones especiales de vacío. En este caso, los átomos de metal se dispersan desde el lugar de evaporación a lo largo de trayectorias rectas. Cuando se encuentran con un objeto, se depositan sobre él en forma de capa; su espesor será mayor en lugares perpendiculares a la dirección de vuelo de las partículas metálicas. En las áreas donde el objeto protege el haz de partículas, aparecerán "sombras". Así, la parte depositada del objeto tiene una mayor densidad que el sustrato depositado (fondo), y por lo tanto el objeto será visible. Este método se usa ampliamente no solo para contrastar virus, ribosomas, sino también para moléculas bastante delgadas de ácidos nucleicos. La desventaja de este método es que conduce a un aumento en el tamaño del objeto por el espesor
capa depositada, que en el mejor de los casos alcanza los 10-15 A. Otra desventaja de la misma es que proporciona información solo sobre la apariencia y el volumen de las partículas. Para el sombreado contrastante, se utilizan platino, paladio, sus aleaciones y uranio.
En caso de contraste negativo de objetos con soluciones de sales de metales pesados, se utilizan molibdato de amonio, acetato de uranilo, ácido fosfotúngstico (PTA) (Fig. 10). Si las soluciones acuosas de tales sustancias se mezclan con objetos biológicos, y luego se aplican a películas de sustrato y se secan, entonces los objetos (por ejemplo, virus o complejos de proteínas) parecerán estar sumergidos en una capa delgada de una sustancia amorfa de alta densidad. sustancia. En un microscopio electrónico, se ven como objetos claros sobre un fondo oscuro (como un negativo fotográfico). La ventaja del método es que las sales disueltas pueden penetrar profundamente en el objeto y revelar sus detalles adicionales. El contraste negativo se usa ampliamente en el estudio de virus y complejos de enzimas de membrana. Moléculas de ácido nucleico filamentoso por este método
están mal identificados debido a su pequeño espesor.
Las sales de metales pesados se pueden utilizar en la llamada tinción positiva. En este caso, el agente de contraste se une a la estructura y aumenta su densidad electrónica. A menudo, las soluciones de acetato de uranilo en alcohol o acetona se utilizan para teñir positivamente los ácidos nucleicos. El acetato de uranilo, ácidos nucleicos contrastantes, tiñe bien las cavidades centrales de los virus esféricos, aumenta significativamente el contraste de los ribosomas y le permite ver hebras delgadas de ácidos nucleicos aislados.
Ultramicrotomía
Al estudiar objetos en un microscopio electrónico, surge otra complicación: este es su grosor. El hecho es que cuando un haz de electrones atraviesa un objeto, algunos de los electrones son absorbidos, lo que provoca el calentamiento del objeto y su deformación. Por lo tanto, es necesario tener objetos delgados (no superiores a 0,1 micras). Otra limitación es que incluso si consideramos objetos inmutables de gran espesor (alrededor de
0.5-1 µm), que es posible en principio (por ejemplo, en un microscopio electrónico de megavoltios, ver más abajo), luego las proyecciones de estructuras ubicadas en diferentes niveles a lo largo del grosor del objeto se superpondrán a la imagen final. Por lo tanto, estudiar la estructura interna de células enteras en microscopios de transmisión es malo e inconveniente. La salida de esta situación es similar a la que se encontró para la microscopía óptica: hacer secciones de espesor muy pequeño, secciones ultrafinas (0,05-0,10 micras).
El procedimiento para su fabricación es en principio similar al utilizado en microscopía óptica. Las células y los tejidos para esto se fijan primero. Las soluciones tampón de glutaraldehído o tetróxido de osmio se utilizan como fijadores. La doble fijación más utilizada: primero el glutaraldehído y luego el osmio, que, como un metal pesado, contrasta las estructuras celulares. Luego, después de la deshidratación, los tejidos se impregnan con resinas epoxi u otros plásticos en un líquido monomérico.
formulario. Durante la polimerización de dichos plásticos, el objeto impregnado con ellos se encierra en bloques sólidos, que ya se pueden cortar en secciones delgadas. Aquí surgen dos problemas: dónde conseguir los cuchillos ideales, cuyos defectos no afectarían el estudio de las células a niveles casi moleculares, y cómo hacer secciones tan delgadas como centésimas de micra. El primer problema se resolvió de esta manera: resultó que las virutas de vidrio tienen una superficie de corte idealmente afilada y sin muescas (Fig. 11). Pero los cuchillos de vidrio duran muy poco, se usan solo una vez. Se utilizan cuchillos de diamante: estos son pequeños diamantes afilados de una manera especial, sirven para varios años.
El problema de hacer una sección ultradelgada también se resolvió, al parecer, simplemente: este es el suministro térmico del objeto. Un bloque con un objeto encerrado en plástico se monta en una barra de metal, que se calienta y, por lo tanto, mueve el objeto hacia adelante una cierta cantidad en un tiempo conocido. Y si este aporte térmico se coordina con ciclos rítmicos
corte, es posible obtener una serie de lonchas de un espesor determinado. Esto se logra utilizando dispositivos especiales: ultramicrótomos. Hay diseños de ultramicrótomos, donde el objeto se alimenta mecánicamente.
El área de las secciones ultrafinas resultantes suele ser muy pequeña (0,1-1 mm2), por lo que todas las operaciones durante la ultramicrotomía están bajo control microscópico. Las secciones montadas sobre rejillas con un sustrato deben contrastarse adicionalmente: "teñidas" con la ayuda de sales de metales pesados. En este caso, también se utilizan sales de plomo y uranio que, al unirse a las estructuras intracelulares en el corte, las contrastan positivamente.
La técnica de hacer secciones ultrafinas ha abierto enormes oportunidades para la aplicación de la microscopía electrónica en literalmente todas las áreas de la biología y la medicina.
Este método permite el uso de técnicas citoquímicas a nivel de microscopía electrónica: en este caso, es necesario que los productos de reacción sean densos en electrones, rechazo
serían electrones. Además, las reacciones no deberían dar lugar a la aparición de patrones de artefactos ya a nivel ultraestructural. La cantidad de métodos citoquímicos en microscopía electrónica aún no es grande, pero esta dirección se está desarrollando intensamente.
En estudios de microscopía electrónica, fue posible aplicar los métodos de autorradiografía. En este caso, se utilizan emulsiones de grano ultrafino (el tamaño de los gránulos es de aproximadamente 0,02-0,06 µm). La desventaja de este método es el tiempo de exposición muy largo, que en algunos casos llega a varios meses.
Cada vez se utilizan más métodos para preparar secciones ultrafinas sin fijación y para incrustar células en plásticos sólidos. Estos son métodos de crioultramicrotomía, es decir, obtención de cortes a partir de tejidos congelados, enfriados instantáneamente a la temperatura del nitrógeno líquido (-196°C). En este caso, se produce una inhibición casi instantánea de todos los procesos metabólicos, y el agua de la fase líquida pasa a un estado sólido, pero no cristalino.
su estructura molecular está desordenada (estado vítreo). Dichos bloques sólidos a la temperatura del nitrógeno líquido se pueden cortar en secciones ultrafinas (la cuchilla también se enfría). Los cortes resultantes se utilizan para detectar la actividad de enzimas en ellos, para realizar sobre ellos reacciones inmunoquímicas, para digestión enzimática, etc.
Para estudios inmunoquímicos, se utilizan anticuerpos que están asociados con partículas de oro coloidal, cuya localización en las preparaciones indica la ubicación del antígeno deseado.
El estudio de las secciones obtenidas en crioultratomos mostró que la estructura general y la composición de los componentes celulares en este caso difieren poco de lo que se observa cuando se utiliza la fijación química y los métodos convencionales para la obtención de secciones ultrafinas. En consecuencia, aquellas estructuras que tienen la misma composición con diferentes métodos de procesamiento del material, aparentemente cerca de su estructura de por vida, no son artefactos.
Esto está respaldado por datos sobre el estudio de células utilizando otros métodos de microscopía electrónica.
El método de congelación-escisión se utiliza para estudiar la estructura de varios componentes de la membrana de una célula. Consiste en el hecho de que el objeto se congela primero rápidamente con nitrógeno líquido y luego se transfiere a una unidad de vacío especial a la misma temperatura. Allí, el objeto congelado se corta mecánicamente con un cuchillo enfriado. En este caso, las zonas internas de las células congeladas quedan expuestas. En el vacío, parte del agua que ha pasado a una forma vítrea se sublima (“grabado”) y la superficie de escisión se cubre secuencialmente con una fina capa de carbono evaporado. , y luego metal. Así, se obtiene una réplica de su clivaje a partir de un material congelado y conservando su estructura intravital (Fig. 12). Luego, ya a temperatura ambiente, el tejido o las células se disuelven en ácidos, pero la película réplica permanece intacta, se estudia al microscopio electrónico. Este método tiene dos ventajas: estudian réplicas a partir de chips
muestras nativas; estudiar el relieve de la superficie de las membranas celulares, que no se puede conseguir por otros métodos. Resultó que también en este caso la organización general de la célula y sus componentes es similar a lo que vemos durante la fijación química o la criotomía. Este método permitió ver que los glóbulos de proteínas integrales se encuentran tanto en la superficie como en el espesor de las membranas celulares, y que las membranas no son uniformes en su estructura.
El método de obtención de réplicas a partir del microrrelieve de una muestra es muy utilizado en el estudio de los componentes fibrilares de una célula. Entonces, cuando se estudia el citoesqueleto de células de cultivo de tejidos o células sanguíneas, las células se tratan con detergentes para disolver todas las membranas. Esto lleva al hecho de que todos los componentes se eliminan por lavado de la célula, excepto los componentes de proteínas fibrilares del citoesqueleto y los materiales nucleares. Estas preparaciones luego se fijan, deshidratan y secan de una manera especial. A continuación, las preparaciones secas se rocían con carbón y se contrastan por rociado.
metales pesados, después de lo cual dicha réplica se retira del vidrio en el que crecieron las células y se observa en un microscopio electrónico de transmisión.
Otros métodos especiales de microscopía electrónica de objetos biológicos.
Recientemente, se han comenzado a utilizar métodos de microscopía de alto voltaje (o más bien, ultra alto voltaje). Se han diseñado dispositivos con un voltaje de aceleración de 1-3 millones de voltios. Estos son dispositivos muy costosos, lo que dificulta su uso generalizado. La ventaja de esta clase de microscopios electrónicos no es que puedan obtener una resolución más alta (a una longitud de onda de electrones más corta), sino que a energías de electrones altas, que son menos absorbidas por el objeto, es posible ver muestras de gran espesor ( 1-10 micras). El uso adicional de imágenes estereoscópicas permite obtener información sobre la organización tridimensional de las estructuras intracelulares con su alta resolución (alrededor de 0,5 nm).
El método de microscopía electrónica de barrido (ráster) permite
estudiar la imagen tridimensional de la superficie celular. En la microscopía electrónica de barrido, un delgado haz de electrones (sonda) recorre la superficie de un objeto y la información obtenida se transmite a un tubo de rayos catódicos. La imagen se puede obtener en electrones reflejados o secundarios. Con este método, un objeto fijo y secado especialmente se cubre con una capa delgada de metal evaporado (generalmente oro), reflejada desde la cual los electrones ingresan a un dispositivo receptor que transmite una señal a un tubo de rayos catódicos. Debido a la enorme profundidad de foco del microscopio de barrido, que es mucho mayor que la del microscopio de transmisión, se obtiene una imagen casi tridimensional de la superficie a estudio. La resolución de este tipo de instrumentos es algo menor que la de los microscopios electrónicos de transmisión, pero ya se están produciendo instrumentos con una resolución de 3 a 5 nm (Fig. 13).
Usando microscopía electrónica de barrido, se puede obtener información sobre la composición química en ciertas áreas.
células. Por lo tanto, el método de microanálisis espectral de rayos X se basa en la identificación y evaluación cuantitativa del contenido de elementos químicos de acuerdo con los espectros de radiación de rayos X característicos que surgen de la interacción de electrones primarios con átomos de un objeto. Para obtener dicha información, por supuesto, los objetos no deben cubrirse con una capa de metal, como en el método habitual de microscopía electrónica de barrido. Además, el objeto debe estar preparado para que no haya pérdida o introducción adicional de elementos. Para ello se utilizan objetos congelados rápidamente y secados al vacío.
Fraccionamiento de células
En citología, se utilizan ampliamente varios métodos de bioquímica, tanto analíticos como preparativos. En este último caso, se pueden obtener varios componentes en forma de fracciones separadas y se puede estudiar su composición química, ultraestructura y propiedades. Entonces, en la actualidad, casi todos los orgánulos y estructuras celulares se obtienen en forma de fracciones puras: núcleos, nucléolos, cromatina,
membranas nucleares, membrana plasmática, vacuolas del retículo endoplásmico, sus ribosomas, ribosomas hialoplásmicos, aparato de Golgi, mitocondrias, sus membranas, plástidos, peroxisomas, microtúbulos, etc., etc. Recientemente se han obtenido fracciones puras de centriolos y poros nucleares.
La obtención de fracciones celulares comienza con la destrucción general de la célula, con su homogeneización. Entonces ya se pueden aislar fracciones de los homogeneizados. Una de las principales formas de aislar estructuras celulares es la centrifugación diferencial (separación). El principio de su aplicación es que el tiempo que tardan las partículas en asentarse en el homogeneizado depende de su tamaño y densidad: cuanto mayor sea la partícula o más pesada sea, más rápido se asentará en el fondo del tubo de ensayo. Para acelerar este proceso de sedimentación, se utilizan las aceleraciones creadas por la centrífuga. Durante la centrifugación, los núcleos y las células intactas se asentarán primero y con aceleraciones pequeñas (1-3 mil g); a 15-30 mil g, partículas grandes, macrosomas que consisten en mitocondrias, pequeños plástidos,
peroxisomas, lisosomas, etc., a 50 mil g, se asentarán microsomas, fragmentos del sistema vacuolar de la célula. Por centrifugación fraccionada repetida de estas subfracciones mixtas, se pueden obtener fracciones puras. Entonces, al separar la subfracción macrosómica, se obtienen por separado mitocondrias, lisosomas y peroxisomas. Al separar los microsomas, es posible obtener una fracción de las membranas del aparato de Golgi, fragmentos de la membrana plasmática, vacuolas y retículo granular. En casos de separación más fina de fracciones, se utiliza la centrifugación en un gradiente de densidad de sacarosa, lo que permite separar bien los componentes, incluso ligeramente diferentes entre sí en gravedad específica.
Las fracciones obtenidas, antes de ser analizadas por métodos bioquímicos, deben comprobarse en cuanto a su pureza mediante un microscopio electrónico.
La obtención de componentes celulares individuales permite estudiar su bioquímica y características funcionales. Entonces puede crear un sistema libre de células para los ribosomas, que
sintetizar una proteína de acuerdo con el ARN mensajero especificado por el experimentador, las mitocondrias aisladas en condiciones seleccionadas pueden llevar a cabo la síntesis de ATP, la síntesis de ARN puede ocurrir en la cromatina aislada con la participación de las enzimas apropiadas, etc.
Recientemente, se han utilizado sistemas libres de células para recrear estructuras supramoleculares celulares. Así, utilizando yemas purificadas a partir de gránulos, extractos del citoplasma de huevos de anfibios o huevos de erizo de mar, es posible obtener núcleos con envoltura nuclear a partir de ADN extraño introducido en este sistema libre de células (por ejemplo, ADN de bacteriófagos). Dicho ADN se une a las proteínas histonas, que se encuentran en exceso en dicho extracto, se forma la cromatina (desoxirribonucleoproteína), que se recubre con una membrana de doble membrana que incluso porta poros nucleares. Dichos sistemas modelo ayudan a estudiar procesos sutiles e íntimos, como el transporte de macromoléculas desde el citoplasma al núcleo y viceversa. En extractos citoplasmáticos de huevos de anfibios y equinodermos
tales núcleos pueden dividirse periódicamente por mitosis. Estos modelos han hecho una enorme contribución al desciframiento de la naturaleza de la regulación del ciclo celular.
Los métodos de ingeniería celular hacen una gran contribución a la biología de la célula. Se descubrió que varias células vivas pueden fusionarse entre sí si sus membranas plasmáticas se tratan de manera especial. Entonces puedes fusionar un eritrocito de pollo y un linfocito humano. En este caso se obtiene una célula binuclear, un heterocarionte, en el que se activa el núcleo de un eritrocito de pollo (Fig. 14). Si un heterocarión se forma a partir de células estrechamente relacionadas (por ejemplo, ratones y hámsteres), cuando entran en mitosis, los cromosomas pueden unirse en una placa de metafase. Después de la separación de dicha célula, se obtendrá una verdadera célula híbrida. Otras técnicas permiten construir células a partir de núcleos y citoplasmas de diferente origen (Fig. 15). Así, al destruir el componente actina del citoesqueleto y someter las células a centrifugación, la célula se puede dividir en dos partes: el núcleo
con un borde estrecho del citoplasma - carioplasto y en el resto del citoplasma - citoplasto. Luego, usando diferentes carioplastos y citoplastos, puedes crear diferentes combinaciones de células reconstruidas.
Los métodos de ingeniería celular se utilizan ampliamente no solo en biología experimental, sino también con fines biotecnológicos. Por ejemplo, en la producción de anticuerpos monoclonales, se utilizan híbridos celulares entre linfocitos de animales inmunizados y células de mieloma que proliferan rápidamente. Los dicariones primarios resultantes forman verdaderas células híbridas que se multiplican intensamente debido al genoma de las células de mieloma tumoral y, al mismo tiempo, liberan una gran cantidad de anticuerpos debido al trabajo del genoma de los linfocitos inmunizados. Esta técnica le permite obtener una gran cantidad de células de hibridoma que producen grandes cantidades de los anticuerpos necesarios.
No es necesario describir todos los métodos y técnicas utilizados en citología para estudiar la estructura, química y
funciones de las células o de sus componentes. Esta breve revisión es suficiente para mostrar la riqueza del arsenal de métodos en citología, que permiten dar un análisis preciso, desde la forma, apariencia general y tamaño de la célula, hasta la composición molecular de sus partes individuales.
Tema 13. La microscopía como método de estudio de células y tejidos.
1. Microscopía óptica.
2. Microscopía electrónica.
La citología moderna cuenta con numerosos y variados métodos de investigación, sin los cuales sería imposible acumular y mejorar el conocimiento sobre la estructura y funciones de las células. En este capítulo, nos familiarizaremos solo con los principales y más importantes métodos de investigación.
El microscopio óptico moderno es un instrumento muy perfecto, que sigue siendo de suma importancia en el estudio de las células y sus orgánulos. Con la ayuda de un microscopio óptico, se logra un aumento de 2000-2500 veces. El aumento de un microscopio depende de su resolución, es decir, la distancia más pequeña entre dos puntos que son visibles por separado.
Cuanto más pequeña es la partícula vista a través de un microscopio, mayor es su poder de resolución. Esta última, a su vez, está determinada por la apertura de la lente (apertura es la apertura efectiva del sistema óptico, determinada por el tamaño de las lentes o aperturas) y la longitud de onda de la luz.
La determinación de la resolución del microscopio se realiza mediante la fórmula: a = 0,6, donde a es la distancia mínima entre dos puntos; - longitud de onda de la luz; n es el índice de refracción del medio situado entre la preparación y la primera lente del objetivo, es decir, frontal; a es el ángulo entre el eje óptico de la lente y el rayo más fuertemente desviado que ingresa a la lente, o el ángulo de difracción de los rayos.
El valor indicado en el denominador de la fracción (n sin a) es constante para cada lente y se llama su apertura numérica. La apertura numérica y el aumento están grabados en el cuerpo del objetivo. La relación entre la apertura numérica y la distancia mínima de resolución es la siguiente: cuanto mayor sea la apertura numérica, menor será esta distancia, es decir, mayor será la resolución del microscopio.
El aumento de la resolución del microscopio, que es absolutamente necesario para estudiar los detalles de la estructura de la célula, se logra de dos maneras:
1) aumento de la apertura numérica del objetivo;
2) una disminución en la longitud de onda de la luz que ilumina la droga.
Los objetivos de inmersión se utilizan para aumentar la apertura numérica. Se utilizan como líquidos: agua (n = 1,33), glicerina (n = 1,45), aceite de cedro (/1 = 1,51) frente a n aire igual a 1.
Dado que el índice de refracción de los líquidos de inmersión es mayor que 1, la apertura numérica del objetivo aumenta y pueden entrar rayos en él, formando un ángulo mayor con el eje óptico del objetivo que cuando hay aire entre la lente frontal del objetivo y el preparación.
La segunda forma de aumentar la resolución del microscopio es usar rayos ultravioleta, cuya longitud de onda es menor que la longitud de onda de los rayos de luz visible.
Sin embargo, la resolución de un microscopio solo se puede aumentar hasta cierto límite, limitado por la longitud de onda de la luz. Las partículas más pequeñas que son claramente visibles en un microscopio óptico moderno deben tener un valor superior a "/3 de la longitud de onda de la luz. Esto significa que cuando se utiliza la parte visible de la luz del día con una longitud de onda de 0,004 a 0,0007 mm, las partículas de al menos 0 0002-0,0003 mm Por lo tanto, con la ayuda de los microscopios modernos es posible considerar aquellos detalles de la estructura celular que tienen un valor de al menos 0,2-0,3 micrones.
En la actualidad, se han creado muchos modelos diferentes de microscopios ópticos. Brindan la posibilidad de un estudio multifacético de las estructuras celulares y sus funciones.
microscopio biológico. El microscopio biológico (MBI-1, MBI-2, MBI-3, MBR, etc.) está diseñado para estudiar preparaciones iluminadas por luz transmitida. Este tipo de microscopio es el más utilizado para estudiar la estructura de las células y otros objetos.
Sin embargo, con la ayuda de un microscopio biológico, es posible estudiar en detalle principalmente preparaciones de células fijadas y teñidas. La mayoría de las células vivas no teñidas son incoloras y transparentes a la luz transmitida (no absorben la luz) y no se pueden ver en detalle.
Contraste microscopico. La imagen de contraste de preparaciones de células vivas, casi invisible cuando se observa en un microscopio biológico, da un dispositivo de contraste de fase).
El método de contraste de fase se basa en el hecho de que las secciones individuales de una preparación transparente difieren del entorno en términos de índice de refracción. Por lo tanto, la luz que pasa a través de ellos se propaga a diferentes velocidades, es decir, experimenta un cambio de fase, que se expresa en un cambio de brillo. Los cambios de fase de las ondas de luz se convierten en vibraciones de luz de diferentes amplitudes, y el ojo percibe una imagen de contraste de la muestra, en la que la distribución de la iluminación corresponde a la distribución de amplias oportunidades en el estudio de las células vivas, sus orgánulos y inclusiones en estado intacto. Esta circunstancia juega un papel importante, ya que la fijación y tinción de las células, por regla general, daña las estructuras celulares.
El dispositivo de contraste de fase para un microscopio biológico consta de un conjunto de objetivos de fase que difieren de los habituales en presencia de una placa de fase anular, un condensador con un conjunto de diafragmas anulares y un microscopio auxiliar que magnifica la imagen del diafragma anular y la placa de fase cuando se combinan.
microscopía de interferencia. El método de contraste de interferencia es similar al método de microscopía de contraste de fase y permite obtener imágenes de contraste de células vivas transparentes sin teñir, así como calcular el peso seco de las células. Un microscopio de interferencia especial utilizado para estos fines está diseñado de tal manera que un haz de rayos de luz paralelos provenientes de una fuente de luz se divide en dos ramas paralelas: una superior y otra inferior.
La rama inferior pasa a través de la preparación y la fase de su oscilación ligera cambia, mientras que la onda superior permanece sin cambios. Para la droga, i.e. en los prismas del objetivo, ambas ramas se reconectan e interfieren entre sí. Como resultado de la interferencia, las secciones de la preparación con diferentes espesores o índices de refracción desiguales se pintan en diferentes colores y se vuelven contrastantes y claramente visibles.
Microscopio fluorescente. Al igual que el método de contraste de fase, la microscopía fluorescente (o luminiscente) permite estudiar una célula viva. La fluorescencia es la luminiscencia de un objeto, excitada por la energía luminosa absorbida por él. La fluorescencia puede ser excitada por los rayos ultravioleta, así como por los rayos azules y violetas.
Varias estructuras y sustancias contenidas en las células tienen su propia fluorescencia (o primaria). Por ejemplo, el pigmento verde clorofila, que se encuentra en los cloroplastos de las células vegetales, tiene una fluorescencia roja brillante característica. Las vitaminas A y B, algunos pigmentos de las células bacterianas dan un brillo bastante brillante; esto permite la identificación de especies bacterianas individuales.
Sin embargo, la mayoría de las sustancias contenidas en las células no tienen fluorescencia propia. Dichas sustancias comienzan a brillar, revelando una variedad de colores, solo después de un tratamiento previo con tintes luminiscentes (fluorescencia secundaria). Estos tintes se denominan fluorocromos. Incluyen fluoresceína, naranja de acridina, sulfato de berberina, floxina y otros. Los fluorocromos generalmente se usan en concentraciones muy bajas (por ejemplo, 1:10 000, 1:100 000) y no dañan una célula viva. Muchos de los fluorocromos tiñen selectivamente estructuras y sustancias celulares individuales con una luz específica. Por lo tanto, bajo ciertas condiciones, la naranja de acridina tiñe el ácido desoxirribonucleico (ADN) de verde y el ácido ribonucleico (ARN) de naranja. Por lo tanto, la fluorescencia secundaria con naranja de acridina es ahora uno de los métodos importantes para estudiar la localización de los ácidos nucleicos en las células de varios organismos.
Además, el uso de fluorocromos permite obtener preparaciones de contraste convenientes para la observación, en las que es fácil encontrar las estructuras deseadas, reconocer las células bacterianas y contarlas. El método de microscopía de fluorescencia también permite estudiar cambios en células y estructuras intracelulares individuales en diferentes estados funcionales, y permite distinguir entre células vivas y muertas.
Cuando se utilizan rayos de luz azul y violeta como fuente de fluorescencia, el equipo consta de un microscopio biológico convencional, una lámpara de bajo voltaje (para un microscopio) y un filtro de luz azul que deja pasar los rayos que excitan la fluorescencia, y un filtro amarillo filtro de luz que elimina el exceso de rayos azules. El uso de rayos ultravioleta como fuente de fluorescencia requiere un microscopio fluorescente especial con óptica de cuarzo que transmita rayos ultravioleta.
Microscopía de polarización. El método de microscopía de polarización se basa en la capacidad de varios componentes de las células y tejidos para refractar la luz polarizada. Algunas estructuras celulares, por ejemplo, las fibras del huso, las miofibrillas, los cilios del epitelio ciliado, etc., se caracterizan por una cierta orientación de las moléculas y tienen la propiedad de birrefringencia. Estas son las llamadas estructuras anisotrópicas.
Las estructuras anisotrópicas se estudian utilizando un microscopio polarizador. Se diferencia de un microscopio biológico convencional en que se coloca un polarizador delante del condensador, y un compensador y un analizador detrás de la preparación y el objetivo, lo que permite un estudio detallado de la birrefringencia en el objeto bajo consideración. En este caso, en las células se suelen observar estructuras claras o coloreadas, cuyo aspecto depende de la posición del fármaco en relación con el plano de polarización y de la magnitud de la birrefringencia.
Un microscopio polarizador permite determinar la orientación de las partículas en las células y otras estructuras, ver claramente las estructuras con birrefringencia y, con el procesamiento adecuado de las preparaciones, es posible realizar observaciones sobre la organización molecular de una u otra parte de la célula. .
Microscopía de campo oscuro. El estudio de preparaciones en un campo oscuro se lleva a cabo utilizando un condensador especial. Un condensador de campo oscuro difiere de un condensador de campo brillante convencional en que transmite solo rayos de borde muy oblicuos de la fuente de luz. Dado que los rayos del borde están fuertemente inclinados, no ingresan al objetivo, y el campo de visión del microscopio es oscuro, y el objeto iluminado por luz difusa parece brillante.
Las preparaciones celulares suelen contener estructuras de diferentes densidades ópticas. Sobre un fondo general oscuro, estas estructuras son claramente visibles debido a su diferente luminiscencia, y brillan porque dispersan los rayos de luz que inciden sobre ellas (efecto Tyndall).
Se puede observar una variedad de células vivas en un campo oscuro.
microscopía ultravioleta. Los rayos ultravioleta (UV) no son percibidos por el ojo humano, por lo que es imposible un estudio directo de las células y sus estructuras en ellas. Con el fin de estudiar las preparaciones celulares en rayos UV, E.M. Brumberg (1939) diseñó el microscopio ultravioleta MUF-1 original, y actualmente se encuentran disponibles varios modelos de este microscopio. Método E.M. Brumberg se basa en el hecho de que muchas sustancias que componen las células tienen espectros de absorción característicos de los rayos UV.
En el estudio de diversas sustancias en células y tejidos vivos o fijados sin teñir en un microscopio de este tipo, la preparación se fotografía tres veces (en la misma placa) en los rayos de tres zonas diferentes del espectro UV.
Para fotografiar, las longitudes de onda UV se seleccionan de modo que cada zona contenga una banda de absorción de una sola sustancia que no absorbe los rayos de las otras dos zonas. Por lo tanto, las sustancias que se ven en las fotografías son diferentes en todas las imágenes.
Las imágenes resultantes luego se colocan en un dispositivo especial llamado cromoscopio. Una fotografía se ve en azul, la segunda en verde y la tercera en rojo.
Se obtienen tres imágenes en color, que se combinan en una en el cromoscopio, y en esta imagen final del objeto, varias sustancias de la célula aparecen coloreadas en diferentes colores.
Pero el microscopio ultravioleta permite no solo fotografiar, sino también hacer observaciones visuales de tejidos y células, para lo cual cuenta con una pantalla fluorescente especial.
Con este microscopio, es posible examinar partículas que son ligeramente más pequeñas que con un microscopio biológico convencional, debido a que los rayos UV tienen una longitud de onda mucho más corta que los rayos de luz ordinarios.
Por lo tanto, la resolución de un microscopio UV es de 0,11 micras, mientras que la resolución de un microscopio biológico con iluminación normal es de 0,2-0,3 micras.
Usando un microscopio ultravioleta, se lleva a cabo una determinación cuantitativa de la absorción de rayos UV por parte de los ácidos nucleicos y otras sustancias contenidas en las células, es decir, se determina la cantidad de estas sustancias en una célula.
Microfotografía. La microfotografía de varias preparaciones microscópicas se lleva a cabo para obtener su imagen ampliada: microfotografía. Es conveniente estudiar estructuras individuales de células y otros objetos en microfotografías; Las microfotografías son documentos que reflejan con gran precisión todos los detalles de la estructura de una preparación microscópica.
Las preparaciones microscópicas se fotografían utilizando dispositivos microfotográficos especiales o cámaras adjuntas microfotográficas. Estos últimos son muy utilizados y son aptos para microfotografía con microscopio biológico y cualquier otro. Una cámara adjunta microfotográfica es una cámara cuya lente ha sido removida y reemplazada por un microscopio.
El sistema óptico del microscopio actúa como lente de esta cámara. Hay varios tipos de accesorios microfotográficos. Los archivos adjuntos de microfotos del tipo MFN-8 son muy convenientes.
También hay un microscopio biológico especial MBI-6 con una cámara permanente. MBI-6 permite el examen visual convencional de las preparaciones y su fotografía en luz transmitida y reflejada, en campos de visión claros y oscuros, con contraste de fase y en luz polarizada.
La microfilmación juega un papel importante en el estudio de los procesos de vida celular. Para estudiar los detalles de los procesos más importantes que ocurren en la célula, como la división, la fagocitosis, los flujos citoplasmáticos, etc., se utiliza un dispositivo de lapso de tiempo.
Con la ayuda de este dispositivo, es posible producir filmaciones aceleradas, que generalmente se usan en procesos de flujo rápido, o filmaciones en cámara lenta de aquellos cambios en la célula que se caracterizan por un curso lento.
La microfilmación no es solo un método que permite estudiar en detalle varias estructuras y procesos en una célula viva, sino también un método para documentar estos procesos y todos los cambios asociados con ellos.
