Introducción. En los últimos años, en relación con los éxitos de la genética molecular, que condujo al mapeo e identificación de los genes de un número significativo de enfermedades hereditarias monogénicas, comenzaron a surgir dificultades en la creación de su estructura de clasificación. Por ejemplo, las mutaciones en el mismo gen pueden conducir tanto a la manifestación de formas clínicas de una enfermedad de diferente gravedad (heterogeneidad alélica) como a la aparición de diferentes manifestaciones clínicas de formas nosológicas (las llamadas "series alélicas"). Uno de los grupos de enfermedades que componen la serie alélica son las laminopatías. Son causadas por mutaciones en el gen LMNA, lo que lleva a un cambio en la estructura y función de la proteína lamina A/C (las laminopatías son enfermedades que se desarrollan como resultado de mutaciones en los genes de las proteínas de la lámina nuclear - ver más abajo).
Se sabe que la cubierta de los núcleos celulares incluye tres componentes principales (ver figura): [ 1 ] membrana externa, [ 2 ] membrana interna y [ 3 ] la delgada placa nuclear que se encuentra debajo de ella: la lámina nuclear (placa: lat. - lámina), formada por complejos de proteínas, que incluyen varios grupos de láminas (proteínas de láminas, ver más abajo). Los filamentos lamin forman dímeros superenrollados paralelos que se polimerizan para formar una red filamentosa en el lado nucleoplásmico de la membrana nuclear interna, anclando los complejos multiproteicos de la membrana nuclear interna y externa (nota: las lamins son un filamento intermedio de clase 5 que se encuentra en todas las células eucariotas, es decir en todas las células con un núcleo formado).
Por lo tanto, las laminas son proteínas estructurales (tienen una masa de 60 - 89 kDa), componentes de la lámina nuclear (lámina nuclear), una red de proteínas que se encuentra debajo de la membrana interna del núcleo y determina su tamaño y forma (es decir, participa en mecánica adhesión e interacción entre las proteínas del nucleoesqueleto y del citoesqueleto). La lámina nuclear proporciona fuerza a la envoltura nuclear y la organización de los poros nucleares, resiste las fuerzas de deformación y protege la cromatina del daño físico. Como lo muestran estudios recientes, junto con la función estructural, las laminas están involucradas en el control de la replicación del ADN, la organización de la cromatina y en la regulación de la expresión génica, el procesamiento y la apoptosis.
Como se mencionó anteriormente, la lámina nuclear consta de cuatro proteínas de lámina: A, B1, B2 y C. Las láminas B1, B2 (también llamadas láminas de tipo B) están codificadas por dos genes, LMNB1 y LMNB2 (ubicados en los cromosomas 5q23 y 19q13, respectivamente) y se sintetizan en todas las células de los animales pluricelulares. Las laminas A y C (las llamadas laminas de tipo A [o lamina A/C]) son productos del empalme alternativo de un solo gen LMNA (ubicado en el primer cromosoma 1q21.2-q21.3 y que consta de 12 exones) y se encuentran en cantidades comparables en tejidos diferenciados de todos los vertebrados, incl. persona.
lee tambien la publicacion: Nomenclatura de los cromosomas humanos(al sitio web)
Nota! Estudios recientes dan pie para considerar a las laminas como una de las principales proteínas que aseguran el sincronismo de la descomposición y restauración de la membrana nuclear durante la división celular. Se ha demostrado que en la profase de la división celular, las laminas se fosforilan, lo que lleva a su desintegración, lo que es una señal de destrucción de la envoltura nuclear. Por el contrario, las láminas se desfosforilan en la telofase, lo que lleva a su agregación. Se cree que el proceso de repolarización de láminas estimula la reparación de la envoltura nuclear. Esto está respaldado por la evidencia de que en la profase del ciclo celular se conserva la conexión de las láminas con fragmentos de la membrana nuclear desintegrada y son una especie de “etiqueta” para los fragmentos de la envoltura nuclear durante su restauración.
Así, las principales funciones de las láminas son: [ 1 ] 1 función clave en el mantenimiento de la forma y la integridad de la envoltura nuclear; [ 2 ] organización y distribución de la cromatina de los poros nucleares; [ 3 ] organización espacial de los procesos de replicación y transcripción del ADN, eventos mitóticos y apoptosis; [ 4 ] participación en diversas vías de señalización; [ 5 ] organización del genoma.
Las mutaciones en el gen LMNA son responsables del desarrollo de más de una decena de enfermedades, denominadas laminopatías, que afectan a diversos tejidos tanto de forma aislada (músculo esquelético y miocardio, tejido adiposo, nervios periféricos) como de forma sistémica (síndrome de envejecimiento prematuro). También se observan fenotipos superpuestos. Junto con la amplia variabilidad clínica, también es característica la pronunciada heterogeneidad genética.
Nota! Hasta la fecha, las mutaciones en el gen LMNA (que codifica para las laminas de tipo A [lamin A/C]) han demostrado ser un factor etiológico 11 ( ! ) formas nosológicas independientes que forman parte de cinco grupos de enfermedades hereditarias: distrofias musculares progresivas, miocardiopatías dilatadas, lipodistrofias, neuropatías sensitivas motoras hereditarias y síndromes de envejecimiento prematuro. Con mayor frecuencia, las mutaciones en el gen LMNA provocan daño en los músculos esqueléticos, el miocardio y el tejido adiposo; con mucha menor frecuencia, son un factor etiológico en los síndromes progeroides, las neuropatías hereditarias y la dermopatía restrictiva letal. Al mismo tiempo, los síndromes anteriores pueden ser causados por mutaciones tanto en los genes de las propias laminas como en los genes de las proteínas asociadas (SREBP1, emerinas) y enzimas involucradas en el procesamiento de las laminas.
nota: MD ED - distrofia muscular de Emery-Dreyfuss; KP MD - distrofia muscular de cinturas; MD - distrofia muscular; DCMP - miocardiopatía dilatada; KMP - miocardiopatía; AD - herencia autosómica dominante; AR - herencia autosómica recesiva 
El mecanismo exacto de desarrollo de las enfermedades asociadas a las láminas aún no se ha estudiado en detalle. Dos hipótesis principales dominan para explicar los fenotipos patológicos observados: la hipótesis estructural y la hipótesis de la "expresión génica". Según la primera, la falta de laminas o el ensamblaje incorrecto de las proteínas lamina mutantes conduce a una disminución de la resistencia de la lámina nuclear ya un aumento de la vulnerabilidad del núcleo y de la célula en su conjunto. En primer lugar, las células sometidas a estrés mecánico, como las células musculares y los cardiomiocitos, sufren con el desarrollo de cambios degenerativos. La segunda hipótesis sugiere una ruptura en la relación entre la lámina nuclear y los factores de transcripción. Recientemente, se ha formulado otra hipótesis, según la cual la mutación de las láminas A/C o la ausencia de láminas de tipo A pueden provocar el tercer mecanismo de patogenia: la descompartimentación temporal (debido a la alteración de la integridad de la membrana nuclear), lo que lleva a un intercambio inadecuado entre los componentes nucleares y citoplásmicos.
Lea más sobre las enfermedades asociadas a la lamina en las siguientes fuentes:
artículo "Características clínicas y genéticas de las laminopatías hereditarias" E.L. Dadali, D. S. Bileva, IV. Ugarov; Centro Científico de Genética Médica de la Academia Rusa de Ciencias Médicas, Moscú; Departamento de Genética, Facultad de Medicina y Biología, Universidad Médica Estatal de Rusia, Moscú (revista "Annals of Clinical and Experimental Neurology" No. 4, 2008) [leer];
artículo "Mutaciones del gen lamin A/C (LMNA) en pacientes con miocardiopatía dilatada y sus manifestaciones fenotípicas" Vaykhanskaya T.G., Sivitskaya L.N., Danilenko N.G., Kurushko T.V., Davydenko O.G. ; Centro Republicano Científico y Práctico "Cardiología", grupo funcional de fisiopatología clínica de la circulación sanguínea, Minsk, Bielorrusia; Institución Científica Estatal "Instituto de Genética y Citología", Academia Nacional de Ciencias, Laboratorio de Herencia No Cromosómica, Minsk, Bielorrusia (Eurasian Journal of Cardiology, No. 1, 2016) [leer];
disertación para el grado de candidato de ciencias médicas "Diversidad clínica y genética y diagnóstico molecular de la distrofia muscular de Emery-Dreyfus" Adyan Tagui Avetikovna, FGBNU "Centro de Investigación Genética Médica", Moscú, 2015 [leer];
presentación "Progeria - Síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford (HGPS)" S. Kokorin, E. Podkhalyuzina, V. Smirnov; Seminario de Biología Molecular; 25/12/2010 (bioinformaticsinstitute.ru) [leer];
artículo "Lipodistrofia parcial familiar (síndrome de Dunnigan) debido a una mutación en el gen LMNA: la primera descripción de un caso clínico en Rusia" E.L. Sorkin, M. F. Kalashnikov, G. A. Melnichenko, A. N. tulipakov; Departamento de Endocrinología, Facultad de Medicina, SBEI HPE “Primera Universidad Médica Estatal de Moscú que lleva el nombre de I.I. ELLOS. Sechenov” del Ministerio de Salud de Rusia, Moscú; Institución Presupuestaria del Estado Federal "Centro de Investigación Endocrinológica" del Ministerio de Salud de Rusia, Moscú (revista "Archivo Terapéutico" No. 3, 2015) [leer]
© Láeso De Liro
Resultados de la etapa: 1) Análisis del contenido de lámina A y lámina B en la envoltura nuclear de células seleccionadas en la primera etapa de las líneas de trabajo (fibroblastos de hámster transformados con Ras con diferente potencial metastásico). En todas las líneas celulares, los anticuerpos contra ambas láminas tiñen los núcleos de forma brillante. En las células HET-SR (baja metástasis), los núcleos tienen una forma regular, la lámina A se detecta tanto en la envoltura nuclear como en el nucleoplasma, la lámina B es más brillante y está presente principalmente en la membrana nuclear. Todas las líneas celulares altamente metastásicas muestran una amplia variedad de formas nucleares, así como la formación de pliegues o acumulaciones desiguales de láminas (Fig. 1). En células transformadas espontáneamente, en las que la transformación se produjo como resultado del cultivo in vitro a largo plazo de la línea celular embrionaria de hámster sirio (ST-HET - células de baja metástasis, ST-HET clon 83/20 - células de alta metástasis) , se observaron cambios similares: en ausencia de una diferencia significativa en la intensidad de tinción de las láminas A y B entre las líneas con metástasis baja y alta, se observó una gran variabilidad en la forma de los núcleos en el clon ST-HET altamente metastásico 83 /20 línea y una distribución desigual de ambas láminas (Fig. 2). El análisis de transferencia Western de la expresión de láminas tampoco mostró diferencias significativas en el contenido de láminas A y B entre células con metástasis bajas y altas (Fig. 3). Dado que las diferencias en la actividad metastásica in vivo pueden depender de la actividad de las metaloproteasas de matriz, se realizó un análisis zimográfico en las líneas estudiadas. Para ello, las células se sembraron en placas Petri de 35 mm a una concentración de 150.000 células por placa, se cultivaron durante 1 día, luego se lavaron 3 veces con medio sin suero y se dejaron en medio sin suero durante 12 horas, y el medio acondicionado fue coleccionado. Posteriormente, se contó el número de células en las placas para normalizar la aplicación de la proteína en el estudio de la actividad de las metaloproteinasas. Para analizar la actividad gelatinasa de las metaloproteasas de la matriz, se mezclaron 10 µl de una alícuota de medio acondicionado con 10 µl de tampón de carga de proteínas de zimografía y se aplicaron al gel. Se realizó electroforesis SDS-PAGE estándar en condiciones estándar en un gel de poliacrilamida al 8% que contenía gelatina al 0,2%, se llevó a cabo la renaturalización durante 30 minutos y se llevó a cabo una reacción de gelatinasa durante 4 horas. Para todas las líneas estudiadas se observó actividad de metaloproteinasa 2, sin embargo, no hubo diferencias significativas en la actividad de metaloproteinasas entre células de baja y alta metástasis (Fig. 4). Por lo tanto, las diferencias en el potencial metastásico de las células de hámster sirio bajo diferentes métodos de transformación no son causadas por un cambio en el contenido de lámina A o lámina B, sino que están asociadas con un cambio en la forma de los núcleos y la distribución de láminas. lo que indica posibles alteraciones tanto en la orientación de las láminas a la membrana nuclear interna como en la regulación del ensamblaje de microdominios de láminas. 2) Análisis de la actividad migratoria de células en un espacio limitado. La actividad de migración celular en función del nivel de expresión de la lamina A y sus variantes de empalme se llevó a cabo en cámaras Boyden con un diámetro de poro de 3 y 8 μm. Para crear un gradiente de quimioatrayente, se añadió suero fetal a la cámara inferior y las células de la cámara superior se incubaron en un medio sin suero (Fig. 5). El análisis se realizó en poblaciones celulares de la línea HT1080 (fibrosarcoma humano), heterogéneas en cuanto al nivel de expresión de GFP-lamin A y GFP-progerin, así como células con knockdown de lamin A (el nivel de knockdown en células individuales es proporcional a la fluorescencia de GFP coexpresada con ARN de horquilla contra la lamina A). El análisis de la eficiencia de la migración se realizó al día siguiente de la siembra mediante un examen microscópico de alto rendimiento y la detección automática del número de células con un nivel superior al umbral de la señal de GFP en ambos lados de la membrana mediante algoritmos optimizados en la etapa anterior de la proyecto. Los resultados del análisis mostraron que la proporción de células que expresan tanto lamina A exógena como progerina se reduce significativamente en la población de células que migraron a través de los poros, lo que indica la inhibición de la migración (Fig. 6). Este efecto depende del tamaño del poro: la eficiencia de la migración a través del poro de 8 µm disminuye un 25 % y un 32 % para la lamina A y la progerina, respectivamente, y al migrar a través del poro de 3 µm, la eficiencia disminuye aún más significativamente - en un 61% y un 66%. Al mismo tiempo, la supresión de la expresión de lamina A no conduce a la activación de la migración (Fig. 7). Aparentemente, dado que estos estudios utilizaron células transformadas con un alto potencial de migración inicial y una alta plasticidad de la envoltura nuclear, una disminución adicional en el nivel de lámina A no contribuye significativamente a la capacidad de las células para migrar a través de los poros. Por lo tanto, en la próxima etapa de los experimentos, se planea utilizar las líneas HSR descritas en el informe anterior, que demuestran diferentes posibilidades de metástasis (invasión a los tejidos del cuerpo), así como sus variantes transgénicas. 3). Para estudiar la migración celular en gel de colágeno 3D, PhaseView desarrolló conjuntamente un algoritmo de imagen de microscopía de iluminación plana optimizada (SPIM). Este algoritmo y su implementación de hardware proporcionan microscopía de luz de iluminación plana 3D (SPIM) con una hoja de luz láser con mayor uniformidad y profundidad de propagación en todo el campo de visión en muestras transparentes y translúcidas de tamaño mediano a grande. En particular, este sistema proporciona medios para mantener el grosor mínimo de la hoja de luz láser dentro del objeto en el área máxima posible para una configuración óptica dada, lo que proporciona una resolución axial uniforme y máxima posible en todo el campo de visión. El sistema se basa en la sincronización de la velocidad y fase del Rolling shutter de una cámara CMOS utilizada para la grabación de imágenes con el movimiento de la silleta de la lámina láser mediante óptica adaptativa instalada en el camino óptico de excitación (Fig. 8). El sistema se ha adaptado específicamente para el análisis de migración celular en gel 3D, ya que SPIM proporciona fototoxicidad reducida y tasas de adquisición de imágenes significativamente más rápidas en comparación con la microscopía confocal láser de barrido puntual, lo que permite observaciones in vivo a largo plazo mientras se analiza un volumen de muestra significativamente mayor. alta resolución espacial y temporal (Fig. 9). Este sistema se utilizará además para analizar el efecto de la inhibición de Zmpste24 en la actividad de migración de células cancerosas en geles 3D. 4) La influencia de la expresión de lamina A exógena y progerina sobre las propiedades mecánicas de la envoltura nuclear en células vivas se analizó mediante microscopía conductora de iones de barrido (SICM). Este método, además de la posibilidad de escanear a alta velocidad el relieve de la superficie de células vivas cultivadas con alta resolución lateral y axial, permite medir las propiedades elásticas de las células (Fig. 10a, b). La medición de los coeficientes de elasticidad del núcleo también es posible gracias a la fina capa de citoplasma que se encuentra sobre el núcleo de la célula, extendida sobre un sustrato de vidrio. Para minimizar la contribución del citoplasma a los parámetros determinados del núcleo, se utilizaron células de fibrosarcoma humano HT1080, demostrando un alto grado de diseminación. Las células se transfectaron con un plásmido que codifica GFP-lamina A o GFP-progerina. Las mediciones se realizaron en un instrumento MNT (Medical Nanotechnologies LLC) instalado en una plataforma fluorescente invertida Eclipse Ti2 (Nikon) el segundo día después de la transfección. Se usó una micropipeta de vidrio en un controlador piezoeléctrico como elemento de escaneo (Fig. 10, a). Las células para escanear se seleccionaron según el nivel de fluorescencia en el canal GFP. En primer lugar, se escaneó el relieve de la celda estudiada. En este caso, la superficie se detecta cuando, al llegar a su límite con una micropipeta de vidrio, la intensidad de la corriente de iones cae entre ~0,25 y 1 %. A continuación, se determinó la rigidez efectiva, que se calculó a partir del desplazamiento final registrado de la membrana después de que la corriente de iones la perforara; en este caso, se determinó el siguiente punto de disminución de la corriente de iones en ~1 %. Se escaneó toda la célula, luego se determinó la posición del núcleo por el punto más alto del relieve. En esta área, se tomaron 10 puntos para el procesamiento, los valores de rigidez para otros 10 puntos se eligieron a lo largo de la periferia celular, mientras que estos puntos no deben ubicarse muy cerca del borde del citoplasma, para que los valores de rigidez del sustrato no se incluiría en la muestra (Fig. 10c). Los resultados de las mediciones de la elasticidad del núcleo se normalizaron a la elasticidad del citoplasma en la región de la lamela. En varios experimentos, las mediciones se realizaron en el contexto del desmontaje del citoesqueleto de actina y tubulina (bajo la acción de nocodazol y citocalasina D), el grado de desmontaje se evaluó mediante inmunotinción de células con anticuerpos contra beta-tubulina o tinción intravital. con SIR-actina. Los resultados preliminares mostraron una correlación directa entre la concentración de GFP-lámina A exógena en el núcleo y la rigidez del núcleo celular (Fig. 11). Se continuará investigando para optimizar el método (selección del diámetro capilar, modificación de algoritmos para el cálculo de la rigidez, etc.) para mejorar la precisión de las medidas, aumentar el tamaño de las muestras y también para estudiar la eficacia de los inhibidores de Zmpste24. 5). El estudio del efecto de la expresión de progerina sobre la organización estructural y el posicionamiento de la heterocromatina periférica se llevó a cabo en un modelo de líneas celulares de hámster chino (CHO), en cuyo genoma se crearía un locus cromosómico artificial que contiene múltiples repeticiones en tándem del operador Lac. estar integrado La formación de imágenes de loci se realizó usando el represor GFP-Lac expresado en células (Robinett et al, 1996). Usamos el clon AO_3 que contiene un locus artificial amplificado (HSR) que demuestra un alto grado de heterocromatinización y está asociado permanentemente con la lámina nuclear (Li et al, 1998; Zhironkina et al., 2014). Las células CHO AO_3 se transfectaron con un plásmido que codifica GFP-progerina, después de 48 horas las células se fijaron e inmunoteñeron con anticuerpos anti-lamina A para diferenciar las señales del represor GFP-Lac y GFP-progerina. La microscopía de inmunofluorescencia y superresolución mostró que la expresión de progerina no provoca una disminución en el grado de compactación, evaluado por cambios en el área de la HSR o la intensidad promedio de fluorescencia de GFP en ella (Fig. 12). Además, no hubo cambios significativos en el posicionamiento de HSR en relación con la envoltura nuclear: en células con un alto nivel de expresión de progerina, la estructura lobulillar del núcleo típica de Progeria Hutchison-Gilford y la formación de numerosas invaginaciones del núcleo. Se revelan las membranas y la HSR siempre permanece asociada con la periferia nuclear o con láminas en áreas de intususcepción. Para estudiar la organización ultraestructural de la cromatina en células que expresan GFP-progerina, utilizamos microscopía inmunoelectrónica con anticuerpos anti-GFP seguida de amplificación Ag de la señal de anticuerpos secundarios marcados con Nanogold. Este enfoque hizo posible identificar las células transfectadas a nivel óptico de luz utilizando microscopía óptica de campo brillante y encontrarlas de manera eficiente en secciones ultrafinas. El análisis de microscopía electrónica mostró que tanto los loci cromosómicos artificiales como las regiones heterocromáticas endógenas de los cromosomas, contrariamente a las hipótesis expresadas anteriormente, conservan su estructura condensada. Sin embargo, en este caso, a menudo hay una pérdida de asociación de la heterocromatina periférica con la lámina nuclear y su movimiento hacia las regiones internas del núcleo (Fig. 13, a). Áreas significativas de la lámina nuclear bajo estas condiciones permanecen libres de contactos con heterocromatina (Fig. 14). 6). Identificación de la gama de los inhibidores competitivos más prometedores utilizando métodos de modelado molecular, estudio adicional de la estabilidad de los complejos enzima-inhibidor mediante métodos de dinámica molecular con el fin de seleccionar compuestos candidatos para el estudio experimental Para ZMPSTE24, la información estructural se determinó mediante la cristalografía datos de la enzima humana recombinante y la proteína de Saccharomyces cerevisiae Ste24p. Al mismo tiempo, solo se conoce una estructura del complejo ZMPSTE24 con uno de los inhibidores de metaloproteasas dependientes de zinc solubles, que proporciona una inhibición competitiva débil de ZMPSTE24, la fosforamidona, que se caracteriza por una baja resolución del método cristalográfico. A pesar de la similitud del sitio activo ZMPSTE24 con algunas metaloproteasas dependientes de zinc, como la termolisina y la neprilisina, la unión de fosforamidón se proporcionó a un nivel significativamente más bajo. Porque los experimentos se llevaron a cabo in vitro evidencia directa de la eficacia de esta clase de inhibidores como fármacos no ha sido identificado. La expectativa de eficacia in vivo actualmente no está respaldada por ningún método; además, la administración de dichos compuestos puede verse obstaculizada por la entrada compleja en el sitio activo ZMPSTE24 formado por la interfaz de interacción enzima-lípido-agua, como describimos en el anterior etapa de trabajo en 2017. Por otro lado, se ha encontrado que una clase de moléculas utilizadas en la terapia antirretroviral en pacientes con VIH pueden inducirles lipodistrofia como resultado de la unión fuera del objetivo de estas moléculas a ZMPSTE24. Al mismo tiempo, lopinovir demostró ser el más efectivo, por lo que se demostró experimentalmente un mecanismo competitivo de inhibición de ZMPSTE24. En vista de las limitaciones descritas, el uso del esquema clásico in silico para la selección de bibliotecas de compuestos químicos, que, por regla general, consiste en la enumeración de un gran número de estructuras aleatorias o actualmente sintetizadas de moléculas orgánicas y su posterior acoplamiento en el estructura cristalográfica estática ZMPSTE24, parece ser ineficaz. La estructura de ZMPSTE24 es una forma bastante única formada por siete hélices transmembrana que encierran una cavidad interna llena de agua de 14.000 anstrom cúbicos incrustada en una bicapa lipídica. La mayoría de los programas de acoplamiento modernos utilizan solo la forma implícita de una solución acuosa en sus cálculos cuando calculan las energías de enlace y no pueden tener en cuenta la influencia de la bicapa lipídica. El uso de estructuras ZMPSTE24 estáticas incrustadas en una bicapa no puede tener en cuenta la especificidad de los bolsillos formados en la interfaz enzima-lípido-agua, así como sus características dinámicas: el modelo de capa lipídica asume una alta movilidad de la parte hidrofóbica de la moléculas de bicapa en comparación con la disposición de cavidades y bolsillos de proteínas estructuralmente estables. La combinación de estos factores conduce a la ineficiencia de un método de búsqueda de inhibidores tan popular como los estudios de relación estructura-actividad (SAR) adaptados a modelos de disolventes acuosos puros. La forma más racional en este caso implica el uso de la estructura básica de las moléculas, cuyo potencial ya se ha demostrado en experimentos in vitro e in vivo, como punto de partida para la búsqueda de modificaciones, cuya introducción proporcionará alta eficiencia vinculante. Por el momento, los mejores candidatos son los peptidomiméticos sintéticos utilizados en la inhibición de las aspartato proteasas, incl. y proteasa del VIH. Para buscar el mecanismo de acción de esta clase de moléculas, que aún se desconoce para ZMPSTE24, desarrollamos un método in silico para buscar sitios de unión, así como para la entrega de moléculas desde la solución, teniendo en cuenta tanto la enzima- interfase lípido-agua y la estructura dinámica de la propia enzima y la membrana circundante. El método se basa en la aplicación de modelos de dinámica molecular en combinación con un método de metadinámica ampliado (ver más abajo). La importancia del enfoque se debe al hecho de que en la literatura ya ha habido un intento de modificar las estructuras de los peptidomiméticos de la proteasa del VIH, con base en la hipótesis de una acción mecánica común de las aspartato proteasas y las proteasas solubles dependientes de zinc. Por analogía, el mecanismo fue propuesto para ZMPSTE24. Al mismo tiempo, esta hipótesis no ha sido confirmada por ningún estudio estructural. En el curso de nuestro estudio, se descubrió un mecanismo de acción completamente nuevo de los peptidomiméticos de la proteasa del VIH, que abre una serie de características e ideas para el diseño racional de un inhibidor eficaz de ZMPSTE24. El algoritmo desarrollado se aplicó para establecer la distribución de los posibles estados conformacionales y tipos de unión de lopinovir en relación con toda la superficie de ZMPSTE24 inmersa en la bicapa lipídica, así como en su cavidad interna y a una distancia de la superficie en el espesor de la solución, tanto acuosa como lipídica. Esto permitió evaluar enérgicamente la unión de lopinovir en todos los sitios de unión potenciales, así como las barreras entre ellos y las posibles rutas de migración desde un solvente externo. Se construyen mapas de energía similares en relación con tres coordenadas del espacio de fase y se presentan como cortes en valores individuales de una de las variables e isosuperficies seleccionadas (Fig. 1.2). Aquellos. para interpretar los mapas de energía multidimensionales obtenidos, es conveniente utilizar valores fijos de una sola variable, por ejemplo, la distancia del centro de masa del lopinovir al centro de masa de la enzima, pero dibujar distribuciones relativas a la otras dos variables, angular θ y φ. El análisis muestra que la penetración de lopinovir desde una solución acuosa en la membrana es difícil debido a la presencia de una barrera. Esta barrera se forma como resultado de las características estructurales de la bicapa lipídica: las partes cargadas de los fosfolípidos que forman la membrana - fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina - se orientan hacia la solución acuosa, formando un potencial de superficie dipolar, que en la etapa inicial de el paso de lopinovir a la membrana proporciona una barrera, tanto estérica como, posiblemente, de entropía observada en los sistemas de lípidos y agua. Porque Dado que lopinavir es un compuesto hidrófobo, su entrada en la capa lipídica es un proceso beneficioso en sí mismo. Sin embargo, el camino de su concentración en las membranas pasa a través de la barrera formada por el potencial de superficie del dipolo. Al mismo tiempo, es posible observar que la penetración de lopinavir en la membrana es energéticamente más favorable en el rango de 60<θ<75 и -160<φ<-180. Эта область соответствует границе липидной мембраны с водным раствором над входом во внутреннюю полость ZMPSTE24, используемым белковым субстратом для проведения каталитического протеолиза. Детальное исследование этой области в процессе молекулярной динамики позволило выявить проседание липидного бислоя вблизи входа в активный центр фермента относительно общей поверхности мембраны (Рис.3). Подобное проседание обеспечивается специфическим распределением заряда на поверхности ZMPSTE24, показанное в ходе одного из этапов работы в 2017г. По всей видимости, мы предполагаем, что проседание формирует разрыв в дипольной части бислоя и облегчает доступ гидрофобных молекул к внутренней гидрофобной части мембраны. Однако, при этом, наименьшим значением энергии соответствует связывание лопинавира на интерфейсе, образованным входом в активный центр фермента и липидным бислоем (75<θ<100 и -160<φ<-180,160<φ<180). Несмотря на возможность проникновения лопиновира во внутреннюю полость фермента, специфического взаимодействия с остатками каталитического центра или областью связывания субстрата обнаружено не было (Рис. 1). Косвенно эти результаты подтверждаются отсутствием кристаллографической структуры ZMPSTE24 в комплексе с лопинавиром в активном центре. Обнаруженный нами механизм связывания также подтверждает и ингибирование лопинавиром фермента по конкурентному типу. Мы также провели подобное исследование в системе фермент-вода без липидного слоя. Подобного типа связывания обнаружено не было (Рис. 2). Это может объяснить отсутствие электронной плотности лопинавира в кристаллах ZMPSTE24, выращенных при добавлении ингибитора, ввиду отсутствия в кристаллах упорядоченной структуры мембраны. Для установления специфических взаимодействий лопинавира в процессе связывания на входе в активный центр мы провели кластерный анализ ансамбля структур ингибитора, обнаруженных в процессе его нахождения в обнаруженном нами центре связывания. Для этого был использован непараметрический байесовский метод кластеризации по основным двугранным углам, определяющим конформацию лопинавира (см. ниже). На предмет специфических взаимодействий был использован самый населенный кластер. Ориентация и конформация лопинавира характеризуется стэкинг-взаимодействием одной из боковых фенильных групп с фениаланиновым аминокислотным остатком фермента, обеспечивающих структуру петли на входе в активный центр, плотным контактном гидрофобных групп аминокислот образующих вход спиралей фермента с боковыми гидрофобными группами лопинавира. Также гидрофобные группировки лопинавира частично остаются в липидном бислое. Кетотетрагидропиримидиновая группировка лопинавира – наиболее полярная часть ингибитора – обращена во внутренню полость фермента, наполненную молекулами воды. Таким образом, мы предлагаем данный центр связывания, как наиболее перспективный с точки зрения связывания конкурентных ингибиторов пептидомиметиков, ввиду наличия как функционально важных заряженных и гидрофобных групп фермента со специфическим паттерном распределения в пространстве, так и особым способом доставки и проникновения в мембрану. В метадинамике к основному потенциалу системы добавляется смещающий гауссов потенциал от коллективных переменных через определенные промежутки времени (формула 1). Высота ω и ширина δs гауссова потенциала и частота τG добавления этого смещающего потенциала к полному потенциалу системы, а также выбор коллективных переменных (CV) являются важнейшими параметрами при таком моделировании. Для построения полной трехмерной карты свободной энергии лопинавира при движении относительно ZMPSTE24 мы должны были подобрать такие CV, который бы описывал этот процесс наиболее точно. Каждую точку на поверхности белка в системе координат связанной с центром масс белка можно задать тремя переменными: два сферических угла θ и φ и расстояние между центром масс белка и лиганда r (Рис. 4). ZMPSTE24 представляет собой мембранный белок, содержащий структуру из трансмембранных альфа-спиралей, образующих камеру внутри белка существенного объем. Поэтому выбор именно таких трех коллективных переменных позволяет исследовать внешнюю и внутреннюю поверхности белка, а также процесс проникновения лопинавира в камеру внутри фермента. Таким образом положение лиганда относительно центра масс белка описывалось обычными сферическими координатами, которые легко перерассчитывались из декартовых компонент радиус-вектора между белком и лигандом (формула 2). Значение ω для потенциала смещения равнялось 5 кДж/моль, ширина потенциалов δsθ и δsφ выбраны 0.1 радиан и 1Å для δsr. Такой выбор этих параметров позволил плавно исследовать всю поверхность свободной энергии. При движение лопинавира от одной точки поверхности белка к другой может быть энергетически выгодно его смещение в раствор. Однако отдаление на значительное расстояние может, с одной стороны, замедлить расчеты, а с другой внести артефакты, связанные с сильным изменением радиуса. Чтобы избежать сильного удаления лопиновира от белка было введено ограничение на координационное число. Координационное число позволяет количественно охарактеризовать степень близости лиганда к белку и рассчитывается по формуле 3. Само число состоит из слагаемых sij, которые равняются 1, если атом j, в данном случае, лиганда расположен не дальше, чем на расстоянии r0 от атома белка i (то есть образует «контакт»), и в любом другом случае равно нулю. Введения ограничения на координационное число позволяет, варьируя параметр r0, контролировать расстояние, на которое ингибитор может отходить от поверхности белка. Параметры для ограничения системы по координационному числу были подобраны в ходе ряда калибровочных запусков метадинамики таким образом, чтобы лиганд имел возможность отходить от белка на расстояние, на котором между ними может оказать растворитель, но при этом достаточно малое, чтобы в случае можно было почувствовать взаимодействие с поверхностью. При сильном отдалении лопиновира от белка средства программы для метадинамики вводят дополнительную энергию таким образом, чтобы сблизить их друг с другом. Это, без дополнительного контроля, может привести к тому, что белок может начать разрушаться. Так происходит потому, что при удалении ингибитора все меньше атомов белка будут находиться в контакте с ингибитором (Рис. 5), а это, в свою очередь, приведет к тому, что системе может оказаться более выгодным начать разрушение белка вместо того, чтобы двигать лиганд в сторону поверхности. Для предотвращения такого исхода дополнительно было введено ограничение значение RMSD всех атомов основной цепи белка. Такой выбор атомов для RMSD позволил предотвратить разрушение структуры фермента, но также не стал препятствием для свободного движения аминокислотных радикалов, которое может происходить в растворе, при взаимодействии с мембраной, а также при взаимодействии с ингибитором. Молекула лопинавира не является стандартной для атомных силовых полей. Точечные заряды на атомах были рассчитаны с применением процедуры RESP. Однако, лопинавир – достаточно большая молекула, поэтому для расчета зарядов он был логично разделен на три части, которые были параметризованы по отдельности (Рис. 6). Такой подход позволил избежать возможных артефактов при расчете заряда, в связи с наличием большего количества конформеров лопинавира. Кроме того, при дальнейшем поиске новых ингибиторов на основе лопинавира, можно будет легко заменять одну или две части молекулы, используя уже известные параметры для остальных константных частей. Параметры силового поля для атомов были выбраны в соответствии с атомным силовым полем GAFF (General Amber Force Field). Молекулярно механическая энергия итоговой молекулы была сопоставлена с квантовой энергией. Сравнение показало, что молекулярно механическая модель, рассчитанные точечные заряды и выбранные параметры поля с высокой степенью точности совпадает с квантовой. Кластеризацию цельной структуры субстрата проводили на базе значений дигедральных углов между углеводными мономерами, с использованием следующей модификации: Отображение фазового пространства углов – в общем случае L-мерного бокса Pc (формула 4). Продуктом отображения является тор Te – L-мерная поверхность на единичной сфере S2L-1. Отображение является локальной изометрией с сохранением меры расстояний. Преобразованные переменные использовали для кластеризации с помощью Байесовского непараметрического метода, имплементированного в программе dpMMlowVar. Оптимизацию углового параметра для данного метода проводили в пределах [-0.6;-0.3] с шагом 0.01 на основании оценочной функции силуэт. При визуализации результатов кластеризации использовали метод главных компонент для трансформированных значений углов с выделением первых трех главных компонент. 11 Июля 2008El problema del control genético de la esperanza de vida y del proceso de envejecimiento tiene múltiples facetas, una de las cuales se destacó en el estudio de las enfermedades hereditarias incluidas en el grupo de las laminopatías. Las laminopatías son un grupo de enfermedades hereditarias causadas por mutaciones en los genes que codifican las proteínas de la lámina nuclear, que forma parte de la cubierta del núcleo celular y juega un papel importante en el mantenimiento de su rigidez.
La envoltura nuclear incluye una membrana nuclear de dos capas, que consta de las capas externa e interna, un complejo de poros nucleares y una lámina nuclear ubicada debajo de la superficie de la membrana nuclear interna. Inicialmente, la lámina se encontró como un componente fibroso del núcleo, consistente en filamentos correspondientes en tamaño a los filamentos intermedios (10–13 nm) [los filamentos intermedios (FI) son elementos de las estructuras del citoesqueleto de los organismos multicelulares y se encuentran tanto en el citoplasma y en el núcleo]. Las características estructurales de los filamentos laminares están determinadas por las proteínas que los forman, llamadas laminas.
Las laminas pertenecen a la superfamilia de proteínas IF, grupo 5 (los 4 grupos restantes son citoplasmáticos) y, debido a sus características estructurales, pueden sufrir modificaciones postraduccionales. El número de proteínas laminas que se encuentran en diferentes metazoos varía. Los humanos (y otros mamíferos) tienen 3 genes que codifican 7 proteínas diferentes. Estas proteínas se dividen en dos tipos: tipo A y tipo B, que difieren en el control genético, el método de síntesis, el patrón de expresión y otras características (Tabla 1, según C.J. Hutchison, 2002 con cambios).
|
tipo lamina |
Expresión |
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A, AD10 * , C |
LMNA |
Splicing alternativo |
células diferenciadas |
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LMNA |
Splicing alternativo |
Línea germinal (expresión específica de esperma) |
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LMNB 1 |
Producto del gen LMNB 1 |
La mayoría de las células |
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LMNB2 |
Splicing alternativo |
La mayoría de las células |
||
|
LMNB2 |
Splicing alternativo |
Solo en espermatocitos |
* - esta lámina también se encontró en algunas líneas de células tumorales.
[El empalme alternativo es una "remodelación" controlada de moléculas de ARN mensajero (ARNm) leídas de un gen, acompañada de la unión de exones de genes en diferentes combinaciones con la formación de varias moléculas de ARNm maduras, esto asegura que un gen codifica varios productos finales y es uno de los principales mecanismos para generar diversidad de proteínas en eucariotas superiores.]
Las láminas B1 y B2 se expresan en la mayoría de las células tanto en embriones como en adultos. De ellos depende la integridad del núcleo, la supervivencia celular y el desarrollo normal. Las laminas tipo A tienen un patrón diferente de expresión que se correlaciona con la diferenciación celular. Esto condujo a la sugerencia de que las láminas de tipo B determinan la viabilidad del organismo, mientras que las láminas de tipo A tienen funciones más especializadas. Existe evidencia de la participación de las laminas en la transcripción y el procesamiento postranscripcional del ARN.
En la última década, las mutaciones en LMNA se han asociado con una serie de enfermedades clínicamente diversas, que se agrupan en un grupo de laminopatías. La intensificación de la investigación en esta dirección provocó un aumento significativo de publicaciones: solo en 2005 su número superó las 200. En las laminopatías, se observan trastornos que conducen a un cambio en la estructura de los músculos estriados y obesidad, polineuropatía, lipodistrofia, miocardiopatía, contribuyendo al desarrollo de resistencia a la insulina, violaciones de la piel, etc.
Pero el fenotipo más dramático causado por mutaciones en LMNA y el posterior trastorno de empalme es la progeria o síndrome de envejecimiento prematuro: síndrome de Hutchinson-Gilford. La presencia de una lámina defectuosa en el núcleo celular conduce a muchos cambios patológicos: el contenido de varias proteínas en el núcleo disminuye drásticamente, la envoltura nuclear se encoge y se interrumpe el proceso de reparación de errores que ocurren durante la síntesis de ADN. Como resultado, las células pierden su capacidad de dividirse, no se reemplazan las células muertas por otras nuevas, lo que conduce al envejecimiento prematuro del cuerpo. Estos pacientes no viven hasta los 20 años y ya a los 10-12 años parecen viejitos.
Un verdadero boom fue el mensaje de P. Scaffidi y T. Misteli en la revista Science (2006), que demostró que el gen LMNA está directamente relacionado no solo con el desarrollo del síndrome de progeria, sino también con el proceso de “normalidad” ( no acelerado - fisiológico) envejecimiento. Los científicos han descubierto que el empalme incorrecto del ARN mensajero de la lamina ocurre no solo en pacientes con progeria, sino también en personas sanas, pero con una frecuencia mucho menor. Aunque la cantidad de lámina defectuosa no aumenta con la edad, con el tiempo (en personas mayores) se observan cambios en las células similares a los de los pacientes con progeria. En un experimento con fibroblastos tomados de personas mayores, se demostró que la supresión del empalme incorrecto condujo al rejuvenecimiento celular.
En un estudio experimental con animales realizado por un grupo de científicos de EE. UU. y Suecia dirigido por L.G. Fong, se demostró que para el funcionamiento normal de las capas del núcleo y la prevención del envejecimiento prematuro del cuerpo, en primer lugar, es necesaria la presencia de lamin C.
En el informe de un grupo de científicos de la Universidad de Massachusetts (julio de 2007), se presenta un dato interesante: mutaciones en el gen LMNB1 llevaron a que el eje del núcleo en las células cambiara de posición y, como resultado, se observó rotación de los núcleos. Estas mutaciones no afectaron la movilidad del citoesqueleto. Si los investigadores expresaban el ADNc de tipo salvaje en las células de ratones LMNB1 -/-, se detenía la rotación de los núcleos. Según los científicos, la lamina B1 puede tener una función de anclaje, proporcionando un vínculo entre la envoltura nuclear y el citoesqueleto. Los ratones defectuosos en el gen LMNB1 murieron en una etapa temprana de desarrollo.
Así, hasta la fecha se han obtenido datos muy interesantes e intrigantes que indican la importancia fundamental de los genes que controlan la estructura y función de las laminas. Sin embargo, el efecto de las laminas sobre la actividad vital y el funcionamiento del organismo en su conjunto aún no se comprende bien y requiere más estudio. Quizás esto lleve al descubrimiento de nuevas oportunidades para combatir la vejez y abra caminos reales hacia la longevidad activa.
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Lámina nuclear (placa nuclear): una red rígida de proteínas fibrilares formada por proteínas de laminina (filamentos intermedios) subyace a la membrana nuclear y la sostiene. Es una capa fibrosa de la membrana nuclear con complejos de poros. Está asociado con proteínas integrales por una capa que consta de filamentos intermedios entrelazados (láminas) que forman el carioesqueleto. Las hebras de ADN cromosómico están unidas a la lámina, es decir, Participa en la organización de la cromatina. Las proteínas de los complejos del poro están relacionadas estructuralmente con las proteínas de la lámina nuclear, la cual está involucrada en su organización. Así, la lámina juega un papel muy importante en el mantenimiento de la forma del núcleo, el empaquetamiento ordenado de la cromatina, la organización estructural de los complejos de poros y la formación del cariolema durante la división celular (desintegración de la membrana nuclear en la profase e integración en la telofase).
75. Cromatina. Cromatina: pequeños granos y grumos, que se encuentran en el núcleo de las células y perciben bien el tinte (cromos), de ahí su nombre. En términos químicos, la cromatina consiste en un complejo de ADN y proteína (también incluye ARN) y corresponde a los cromosomas, que están representados por hilos delgados en el núcleo de la interfase y son indistinguibles como estructuras individuales. La cromatina es la sustancia de los cromosomas. La cromatina consiste en fibrillas de cromatina, que pueden ubicarse sueltas o compactas en el núcleo. Sobre esta base, se distinguen dos tipos de cromatina: eucromatina: cromatina suelta o descondensada (desspiralizada), débilmente teñida con tintes básicos y no es visible en un microscopio óptico, está disponible para la transcripción; heterocromatina - cromatina compacta o condensada (en espiral), se tiñe bien con los mismos tintes y es visible bajo un microscopio óptico. Durante la preparación de una célula para la división (interfase), las fibrillas de cromatina forman espirales en el núcleo y la cromatina se convierte en cromosomas. Después de la división en los núcleos de las células hijas, se produce la desespiralización de las fibrillas de cromatina y los cromosomas se convierten nuevamente en cromatina. Por tanto, la cromatina y los cromosomas son fases diferentes de una misma sustancia. Por lo tanto, de acuerdo con las características morfológicas del núcleo (por la proporción del contenido de eu y heterocromatina), se puede evaluar la actividad de los procesos de transcripción (la función sintética de la célula).Con su aumento, esta proporción cambia a favor de eucromatina, y viceversa Con la supresión completa de la función del núcleo (por ejemplo, en células dañadas y moribundas, durante la queratinización del epitelio) disminuye de tamaño, contiene solo heterocromatina y se tiñe con tintes básicos de manera intensa y uniforme. Este fenómeno se llama cariopicnosis. La distribución de heterocromatina y la proporción del contenido de eu- y heterocromatina son características de las células de cada tipo, lo que permite su identificación. Al mismo tiempo, existen regularidades generales en la distribución de la heterocromatina en el núcleo: sus acumulaciones se localizan bajo el cariolema, interrumpidas en la región de los poros (debido a su conexión con la lámina) y alrededor del nucléolo. Grupos más pequeños están dispersos por todo el núcleo. El cuerpo de Bar es un grupo de heterocromatina correspondiente a un cromosoma X en las mujeres, que está torcido e inactivo en la interfase. En la mayoría de las células, se encuentra cerca del cariolema y en los granulocitos de la sangre parece un pequeño segmento adicional del núcleo ("baqueta de tambor"). La detección de cuerpos de barra (generalmente en células epiteliales de la mucosa oral) se utiliza como prueba de diagnóstico para determinar el sexo genético.
76. Cromatina difusa y condensada (eu- y heterocromatina).
Cromatina: pequeños granos y grumos, que se encuentran en el núcleo de las células y perciben bien el tinte (cromos), de ahí su nombre. En términos químicos, la cromatina consiste en un complejo de ADN, ARN y proteína, donde el ADN se encuentra en diversos grados de condensación, y corresponde a los cromosomas, que están representados por hilos delgados en el núcleo en interfase y son indistinguibles como estructuras individuales. La cromatina es la sustancia de los cromosomas. La cromatina consiste en fibrillas de cromatina, que pueden ubicarse sueltas o compactas en el núcleo. Sobre esta base, se distinguen dos tipos de cromatina: eucromatina: cromatina suelta o descondensada (desspiralizada), débilmente teñida con tintes básicos y no es visible en un microscopio óptico, está disponible para la transcripción; heterocromatina - cromatina compacta o condensada (en espiral), se tiñe bien con los mismos tintes y es visible bajo un microscopio óptico. Durante la preparación de una célula para la división (interfase), las fibrillas de cromatina forman espirales en el núcleo y la cromatina se convierte en cromosomas. Después de la división en los núcleos de las células hijas, se produce la desespiralización de las fibrillas de cromatina y los cromosomas se convierten nuevamente en cromatina. Por tanto, la cromatina y los cromosomas son fases diferentes de una misma sustancia. Por lo tanto, de acuerdo con las características morfológicas del núcleo (por la proporción del contenido de eu y heterocromatina), se puede evaluar la actividad de los procesos de transcripción (la función sintética de la célula).Con su aumento, esta proporción cambia a favor de eucromatina, y viceversa Con la supresión completa de la función del núcleo (por ejemplo, en células dañadas y moribundas, durante la queratinización del epitelio) disminuye de tamaño, contiene solo heterocromatina y se tiñe con tintes básicos de manera intensa y uniforme. Este fenómeno se llama cariopicnosis. La distribución de heterocromatina y la proporción del contenido de eu- y heterocromatina son características de las células de cada tipo, lo que permite su identificación. Al mismo tiempo, existen regularidades generales en la distribución de la heterocromatina en el núcleo: sus acumulaciones se localizan bajo el cariolema, interrumpidas en la región del poro (por su conexión con la lámina) y alrededor del nucléolo (perinuclear). Grupos más pequeños están dispersos por todo el núcleo. El cuerpo de Bar es un grupo de heterocromatina correspondiente a un cromosoma X en las mujeres, que está torcido e inactivo en la interfase. En la mayoría de las células, se encuentra cerca del cariolema y en los granulocitos de la sangre parece un pequeño segmento adicional del núcleo ("baqueta de tambor"). La detección de cuerpos de barra (generalmente en células epiteliales de la mucosa oral) se utiliza como prueba de diagnóstico para determinar el sexo genético.
